【正文】 基因或構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組DNA文庫(kù)等。⑶ 黏粒文庫(kù)黏粒又稱柯斯質(zhì)粒，是由l噬菌體的cos序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列及抗生素抗性基因構(gòu)建而成的一類(lèi)特殊的質(zhì)粒載體。噬菌體文庫(kù)中應(yīng)用最廣泛的是l噬菌體。⑵ 噬菌體文庫(kù)噬菌體文庫(kù)是以細(xì)菌噬菌體基因組衍生的一系列載體系統(tǒng)構(gòu)建的，常用的有l(wèi)噬菌體載體、M13單鏈?zhǔn)删w載體、P1噬菌體載體及由噬菌體衍生的質(zhì)粒載體。第十一章1. 基因組DNA文庫(kù)有哪些類(lèi)型？其相關(guān)的特點(diǎn)是什么？⑴ 質(zhì)粒文庫(kù)質(zhì)粒載體所容納的外源DNA片段一般在10kb以內(nèi)。雙脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的3‘位置的OH缺失，致使下位核苷酸的5‘磷酸基團(tuán)無(wú)法與之結(jié)合。 測(cè)定長(zhǎng)度大約250個(gè)堿基。應(yīng)用: MaxamGilbert化學(xué)降解測(cè)序法不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會(huì)產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來(lái)的誤差；對(duì)未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測(cè)序。原理：將待測(cè)DNA片段的5‘端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)并列點(diǎn)樣（lanebylane）的方式用凝膠電泳進(jìn)行分離，再經(jīng)放射自顯影，即可讀出目的DNA的堿基序列。⑤ 引物的3′末端最好是G或C，但不要GC連排。③ 避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列（3個(gè)堿基）④ G＋C含量盡量控制在40%60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。3. PCR技術(shù)有哪些應(yīng)用？4. PCR引物有哪些基本要求？① 長(zhǎng)度：至少16 bp，通常為1830 bp，更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性。2. T/A克隆的基本原理是什么？Tap DNA聚合酶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3’末端添加一個(gè)核苷酸，通常為A。過(guò)程：（1）變性（denaturation）：將模板DNA置于9296℃，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)（2）退火（annealing）：將溫度降至3772℃，使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合（3）延伸（extension）：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘OH端，合成DNA。據(jù)此來(lái)決定PCR策略。在體外采用變性、退火、延伸過(guò)程，以含有目的片段的DNA為模板，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，在DNA聚合酶作用下實(shí)現(xiàn)目的基因擴(kuò)增。（1）在表達(dá)載體上使用T7啟動(dòng)子，在宿主細(xì)胞中表達(dá)T7 RNA聚合酶，構(gòu)成了表達(dá)系統(tǒng)。工作原理：pET載體進(jìn)入大腸桿菌BL21（DE3）中后，由于宿主細(xì)胞的的lac I基因表達(dá)產(chǎn)生阻遏物，從而抑制T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)，在載體上的目的基因也無(wú)法表達(dá)，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)物加入時(shí)，使阻遏物失去抑制作用，T7 RNA聚合酶基因可以表達(dá)，從而啟動(dòng)T7啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá)。在當(dāng)阻抑物結(jié)合在lacO位點(diǎn)時(shí)，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也無(wú)法表達(dá)。在pET載體上裝載lacⅠ基因，提高阻抑物的濃度。該溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，從而減少在未誘導(dǎo)情況下外源基因的表達(dá)。（3）大腸桿菌BL21（DE3）是常用的pET表達(dá)載體的宿主菌，該菌對(duì)T7 RNA聚合酶和目的基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)行多層次的調(diào)控。（1）T7噬菌體啟動(dòng)子只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識(shí)別并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而大腸桿菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌體啟動(dòng)子。（4）維持pH4—10，防止核酸在堿性條件下降解。（2）盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短時(shí)間。（4）在原核細(xì)胞中，真核基因所表達(dá)出的蛋白往往不能進(jìn)行正常的折疊，而形成沒(méi)有活性的包涵體。（2）細(xì)菌的RNA聚合酶無(wú)法識(shí)別真核啟動(dòng)子。稀有密碼子的地方會(huì)成為表達(dá)瓶頸，對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)突變。4. 將人的某個(gè)基因在大腸桿菌中表達(dá)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？（1）序列為去掉內(nèi)含子的cDNA序列（2）要用原核啟動(dòng)子。大腸桿菌釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有分別來(lái)自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)與選擇標(biāo)記，另有一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)。（3）翻譯的有效性 3. 何為穿梭載體，在遺傳結(jié)構(gòu)上有何特點(diǎn)？穿梭載體（shuttle vector）是能夠在兩類(lèi)不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制。（2）轉(zhuǎn)錄有效性，以防止轉(zhuǎn)錄提前終止。：使宿主表現(xiàn)出一種特殊性或啟動(dòng)其他產(chǎn)物合成。表達(dá)載體實(shí)際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達(dá)所需的元件，當(dāng)外源基因被接入合適的位點(diǎn)后，在宿主中啟動(dòng)表達(dá)，因此表達(dá)載體的構(gòu)建原則主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用。⑶ 核糖體結(jié)合位點(diǎn)： 細(xì)胞中的核糖體必須在mRNA上找到有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）以及其中的ShineDalgarno序列（SD序列），從而啟動(dòng)鄰近其下游的翻譯起始密碼子的蛋白質(zhì)翻譯。當(dāng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)以后，RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子下游要轉(zhuǎn)錄的序列是無(wú)法識(shí)別的，這就為利用強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)目的基因提供了可能。⑷ 克隆位點(diǎn)： sacB內(nèi)部⑸ 填充片段：11kb腺病毒，作為填充物彌補(bǔ)外源DNA片段長(zhǎng)度。⑴ 復(fù)制元件：質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子⑵ 環(huán)化和包裝信號(hào)：2個(gè)loxP重組位點(diǎn)和包裝識(shí)別位點(diǎn)pac,用于體外包裝⑶ 標(biāo)記基因：kanr。而且，購(gòu)買(mǎi)包裝蛋白的費(fèi)用較高。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。（2）含不同重組DNA的菌落生長(zhǎng)速度不一。低拷貝性可以減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。YAC：自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere, CEN）和兩個(gè)端粒（TEL）。第四章1. 大容量克隆載體有哪些種類(lèi)，各有何特點(diǎn)？黏粒載體（cosmid）；酵母人工染色體載體（YAC）；細(xì)菌人工染色體載體(BAC)； P1噬菌體載體(P1)；P1人工染色體載體(PAC)2. 簡(jiǎn)述黏粒、YAC、BAC克隆載體基本構(gòu)成元件。突變的基因II產(chǎn)物減弱了與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的作用。(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴(kuò)增。琥珀突變：在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA），或琥珀突變（突變?yōu)閁AG），或乳白突變（突變?yōu)閁GA）。當(dāng)外源DNA 片段插入tetr 基因后，導(dǎo)致tetr 基tet tet 因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。5. 解釋下列名詞: 基因工程載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞(host cell)、酵母的質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA的衍生物等，經(jīng)過(guò)改造都可以成為載體。(2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類(lèi)型的分子(尤其是雙鏈分子)比較費(fèi)力，同時(shí)由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失，培養(yǎng)時(shí)間不能長(zhǎng)，故所得DNA的量有限。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15 放在F 質(zhì)粒上,隨宿主傳代； lacZ ’放在載體上, 作為篩選標(biāo)記。若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的β半乳糖苷酶片段。這兩個(gè)無(wú)酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù)β半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。lacZ△M15 基因是編碼缺失了β半乳糖苷