【正文】 目的基因與載體的連接方法（1）黏性末端連接：將靶基因DNA片段和載體DNA經(jīng)過相同的限制酶進行切割，使他們兩端產(chǎn)生相同的黏性末端，然后經(jīng)黏性末端堿基配對和DNA連接酶的作用，共價連接成為新的重組DNA分子。(1)．基因及其產(chǎn)物的共線性 (2)．基因及其產(chǎn)物的非共線性(3)．基因的重疊與基因的可變性 (4)．啟動子和終止子4. 重組DNA技術包括哪些步驟分分離制備目的基因切切割目的基因和載體接目的基因與載體連接轉(zhuǎn)將重組DNA導入宿主細胞篩篩選并檢定含有重組DNA分子的受體細胞克隆表克隆基因在受體細胞中進行復制與表達5. 基因工程的流程目的基因的分離制備→與載體體外重組→遺傳轉(zhuǎn)化→轉(zhuǎn)化子篩選→提取目的基因→測序 ↓獲得優(yōu)良品種 ←表達特定蛋白產(chǎn)物←導入宿主細胞←將目的基因克隆到表達載體(1)限制性核酸內(nèi)切酶：在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進行切割(2)DNA連接酶：將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體(3)DNA聚合酶I：通過向3’端逐一增加核苷酸以填補雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性(4) Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。、339。(2) 具有抗菌素抗性基因，便于篩選。4. 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問題？(1)較大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌體擴增過程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長的噬菌體更具競爭優(yōu)勢所致。BAC：復制單元的特殊性:來自F質(zhì)粒，包括嚴謹型控制的復制區(qū)oriS，啟動DNA復制的由ATP驅(qū)動的解旋酶（RepE）以及3個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座（parA、parB和parC）。2. 簡述表達載體構(gòu)建的一般原則。（3）表達出的真核蛋白產(chǎn)物易被細菌的蛋白酶降解。只有當誘導物存在時，才能解開T7 RNA聚合酶基因和外源基因表達的雙重阻遏。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3′末端的重復排列。由于其有利于利用分子雜交的方法進行篩選，用l噬菌體構(gòu)建的基因組DNA文庫在小基因組物種的基因克隆中起著重要作用。Ti質(zhì)粒有兩個區(qū)域：TDNA區(qū)（是質(zhì)粒上能夠轉(zhuǎn)移整合入植物受體基因組并能在植物細胞中表達從而導致冠癭瘤的發(fā)生，且可通過減數(shù)分裂傳遞給子代的區(qū)域）和Vir區(qū)（編碼能夠?qū)崿F(xiàn)TDNA轉(zhuǎn)移的蛋白）。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動物體內(nèi)的方法。不足(1)較難進行高密度發(fā)酵：乙醇的產(chǎn)生和影響(2)蛋白質(zhì)的分泌能力較差(3)過度糖基化修飾，平均50150個甘露糖殘基2. 作為一個酵母表達載體，包括那些基本元件？①啟動子：最常用的啟動子是基因AOX1的啟動子② 選擇標記：常用HIS4，以及ARGTRP1或URA3作選擇標記的載體。確保整合：通過對新霉素抗性篩選獲得整合外源基因的細胞，通過添加丙氧鳥苷（GANC）到細胞，剔除隨機整合的細胞，獲得定點整合的細胞克隆。在宿主細胞質(zhì)中，兩條相同的RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝于內(nèi)殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽殖方式分泌至細胞外，但通常不致死宿主細胞2. 動物基因工程中載體的類型及功能類型： ：腺病毒，與腺病毒相關病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒功能：3. 簡述基因?qū)雱游锛毎姆椒ㄏ蛘婧思毎D(zhuǎn)移外源基因的方法大致可分為下面3類：(1)．物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法(2)．化學轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體融合法(3)．病毒感染法制備轉(zhuǎn)基因動物常用的方法：常用的有顯微注射法、胚胎干細胞介導法和核移植法。加入帶有幾個dG的特異性引物,該引物會與第一鏈互補結(jié)合，再繼續(xù)合成第二鏈。這類基因組DNA文庫一般應用于“鳥槍法”全基因組測序研究和用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。因此，Tap DNA聚合酶擴增的產(chǎn)物可與T載體進行黏端互補連接，達到高效克隆的目的。檢查真核基因密碼子偏好是否存在原核表達系統(tǒng)的稀有密碼子。第五章1. 以大腸桿菌為例，表達載體比克隆載體多了哪些功能元件，各有什么生物學功能？⑴ 啟動子：轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶在啟動子部位啟動RNA轉(zhuǎn)錄的過程。生物學功能：當與噬菌粒載體共同存在于宿主細胞時M13KO7表達后的基因產(chǎn)物優(yōu)先作用于噬菌粒，使其進行單鏈復制。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個堿基對的多克隆位點），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。 RNA外切核酸酶活性 339。也稱為Klenow片段（Klenow frgment）， DNA聚合酶Ⅰ大片段（ DNA polymeraseⅠlargefragment）。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A 成為N6 甲基腺膘呤，胞嘧啶C 成為5‘ 甲基胞嘧啶?；虿僮? 對基因進行分離、分析、改造、檢測、表達、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。第二章1. 什么是細菌的限制－修飾系統(tǒng)，其功能是什么？細胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細胞中有限制—修飾系統(tǒng)(RMRestrictionmodification system)。4度過夜也是有很高的連接效率。 DNA外切酶活性T4 DNA聚合酶:3’5’DNA外切酶活性T7 DNA聚合酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。lacZ△M15 基因是編碼缺失了β半乳糖苷酶中第1141 個氨基酸的lacZ 基因無酶學活性。(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴增。⑴ 復制元件：質(zhì)粒復制子和裂解性復制子⑵ 環(huán)化和包裝信號：2個loxP重組位點和包裝識別位點pac,用于體外包裝⑶ 標記基因：kanr。大腸桿菌釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復制起點與選擇標記，另有一個多克隆位點區(qū)。（3）大腸桿菌BL21（DE3）是常用的pET表達載體的宿主菌，該菌對T7 RNA聚合酶和目的基因的轉(zhuǎn)錄實行多層次的調(diào)控。過程：（1）變性（denaturation）：將模板DNA置于9296℃，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學性質(zhì)（2）退火（annealing）：將溫度降至3772℃，使引物與模板的互補區(qū)相結(jié)合（3）延伸（extension）：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘OH端，合成DNA。雙脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的3‘位置的OH缺失，致使下位核苷酸的5‘磷酸基團無法與之結(jié)合。3. 扣除cDNA的基本原理是什么？將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本（tester），將基因表達譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為對照樣本（driver）。第十四章1. 簡