【正文】 和染色體DNA變性，同時沉淀蛋白質。（2）平頭末端連接:將平末端的DNA分子在T4連接酶的作用下，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵相互連接。RM系統是細菌安內御外的積極措施。2. 說明限制性內切核酸酶命名原則（舉例）。(2)反應底物為粘端、切口、平端的RNA或DNA。作cDNA克隆時，不會將RNA連接到DNA，不連接RNA。因此連接反應常采用的最佳溫度一般在416℃間，通常多選用1216℃ 30分鐘到16小時。② 抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性③ 通過置換反應對DNA進行末端標記④ 在cDNA克隆中合成第二鏈⑤ 隨機引物標記⑥ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA7. 分子克隆的基本流程 8. 什么是限制性內切酶？可劃為哪幾個類型？識別序列有結構特點？限制性核酸內切酶是由細菌產生的一類能夠特異性識別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內切酶。當一個樣本DNA被一個特定的限制酶切割后，可以產生一批相同的堿基序列的DNA片段，進而可以被用于基因重組、克隆、核酸分子雜交和序列分析等。539。539。RNA外切酶活性12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？重組DNA導入受體細胞后，檢測目的基因是否表達的第一個步驟就是篩選。(4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數，便于制備。若在該DNA 小片段中再插入一個大片段，導致產生無α互補能力的β半乳糖苷酶片段。對于只編碼N端140 個氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ′) ，其產物也沒有酶學活性。利用這一互補性質，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質粒。(3)重組中，經常出現一些能以兩種可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNA片段的情況，這是因為外源DNA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。？遺傳學特性：基因II基因突變，由G變?yōu)門。黏粒：質粒復制起點（ColE1）、抗性標記（ampr）、cos位點。標記基因:氯霉素抗性基因3. 黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點？優(yōu)（1）同時具有λ噬菌體和質粒載體的特性（2）具有高容量的克隆能力缺（1）兩個粘粒之間，當存在同源序列時，可能會發(fā)生重組，結果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。（3）包裝蛋白制備過程較復雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。果聚糖蔗糖酶基因sacB，含sacB的大腸桿菌在蔗糖培養(yǎng)基上不能存活，用于插入失活篩選重組子。⑵ 終止子：轉錄會受到模板RNA序列結構的影響，當遇到頸環(huán)結構時轉錄便會停止，或遇到ρ因子介導的終止信號轉錄也會停止。（1）啟動子選擇：以獲得最大限度的目的產物，則選擇高強啟動子，在適當條件下可使外源基因高水平表達，如大腸桿菌的Plac。，使轉錄確有效終止。此類型的載體既可在大腸桿菌細胞和釀酒酵母細胞中復制，可實現在兩種不同的寄主細胞之間來回轉移基因，并單獨或同時在兩種宿主細胞中研究目的基因的表達活性及其它的調節(jié)功能。（3）若單獨的蛋白無活性，考慮是否統一起到克服分子伴侶的基因（4）控制表達條件，盡量不要形成包涵體？（1）真核基因含有內含子序列，原核細胞中無法切除內含子，從而無法表達蛋白產物。？（1）由于RNA是單鏈，易受到核酸酶的攻擊，應盡量避免RNA的降解。7. 簡述PET表達系統的特點及工作原理特點：表達載體pET5a是典型的pET載體，含T7噬菌體啟動子序列，當外源基因插入其下游的幾個酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。（4）控制外源基因嚴謹表達的2個系統 RNA聚合酶的量來實現的在宿主細胞中引入一個帶有T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質粒，它們表達T7噬菌體的溶菌酶。也可利用T7lac啟動子。目的基因的基本信息：片段大小、序列和堿基特點等。這三個熱反應過程的重復稱為一個循環(huán)，經過2040個循環(huán)可擴增得到大量位于兩條引物之間序列的DNA片段。② 解鏈溫度（Tm值）：兩個引物之間的Tm值差異最好在25℃。第九章1. 簡述化學降解法測序的基本原理以及主要應用范圍?；瘜W降解測序法特別適用于測定含有如5甲基腺嘌呤、G＋C含量較高的DNA片段以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。一旦雙脫氧核苷酸整合到正在合成的DNA鏈中，該股DNA的合成就到此終止。 M13載體所容納的外源片段較小，一般用于構建cDNA文庫或BAC和PAC亞克隆文庫。黏粒載體和噬菌體載體類似，主要用于構建小基因組物種的基因組DNA文庫。⑸ 亞基因組文庫亞基因組文庫是相對于基因組文庫提出的，文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段（如一個YAC或BAC克隆等）。將tester和driver的cDNA進行多次雜交，去掉在二者之間都表達的基因，而保留兩者之間差異表達的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達的基因的可能性也大大提高。第十三章1. 植物基因轉化受體系統具備的條件？（1）較高的遺傳穩(wěn)定性 （2）具有穩(wěn)定的外植體來源（3）對選擇抗生素敏感 （4）對農桿菌有敏感性（5）是否具有經濟價值或有潛在的生產應用價值2. 植物基因工程常用的受體系統有哪些？(1)愈傷組織再生系統(2)直接分化再生系統(3)原生質體再生系統(4)生殖細胞受體系統3. 植物基因轉化方法有哪些？(1)原生質體介導法: PEG介導的基因轉化，脂質體介導基因轉化，電激法介導基因轉化，顯微注射介導的基因轉化，激光微束介導的基因轉化(2)基因槍法(3)根癌農桿菌介導法4. 農桿菌轉化的基本原理及分子機理？在根癌農桿菌內有一個大的致瘤質粒（tumor inducing plasmid），簡稱Ti質粒。農桿菌侵染植物首先是吸附于植物表面?zhèn)?，受傷植物分泌的酚類小分子化合物可以誘導Vir基因的表達。其次，二元載體的外源基因的轉化效率要高于一元載體。反轉錄病毒基因組整合到宿主細胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復制而復制并由5‘LTR中的一個強啟動子轉錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時又具有mRNA模板活性，翻譯出結構。胚胎干細胞介導法是將外源基因導入胚胎干細胞，然后將轉基因的胚胎干細胞注射入受體動物胚胎后，可參與宿主的胚胎構成，形成嵌合體，直至達到種系嵌合。DNA顯微注射法制備轉基因小鼠⑴ 超數排卵對年輕、健康未孕母鼠（45周齡）注射促性腺激素，誘導超數排卵，與種公鼠合籠交配，從輸卵管的壺腹部收集原核期受精卵。⑷ 胚胎移植胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依據早期胚胎的發(fā)育階段和物種的不同決定移植的部位。7. 什么是定向打靶技術和定向打靶載體？如何確保外源基因的定向整合？基因打靶是通過外源基因與靶細胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點整合到靶細胞特定位置上，而使某一個特定位點上的基因發(fā)生定點突變的技術。第十五章1. 舉例說明酵母基因工程相對于大腸桿菌基因工程的優(yōu)勢與不足。這兩個結構域的功能是獨立的