【正文】 源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等應(yīng)避免外源基因表達(dá)的“葡萄糖效應(yīng)”。④目的基因表達(dá)盒“轉(zhuǎn)錄過(guò)頭”，影響Ori區(qū)域。②目的蛋白高效表達(dá)——在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù) ③目的產(chǎn)物回收困難四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化(1)工程菌構(gòu)建與分析(2)工程菌遺傳穩(wěn)定性分析 在非選擇條件下連續(xù)傳代數(shù)代后，對(duì)工程菌重組質(zhì)粒存在狀況、結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性進(jìn)行一下三項(xiàng)分析： A、存在狀況：宏觀逃逸率 B、結(jié)構(gòu)完整性：酶切圖譜分析、序列分析 C、功能完整性：表達(dá)水平工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性（主要）：整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失重組質(zhì)粒的逃逸：工程菌部分細(xì)胞因質(zhì)粒丟失而不再攜帶重組質(zhì)粒的現(xiàn)象。主要用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備。以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)A、分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：①目的蛋白以呈正確折疊的可溶形式存在（周質(zhì)為氧化型環(huán)境，利于二硫鍵形成）②目的蛋白穩(wěn)定性高（周質(zhì)腔蛋白酶少）③目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去 B分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。4℃、DTT條件下切割。包涵體的復(fù)性與重折疊的主要挑戰(zhàn)是： 聚集沉淀融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)①目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳 ②目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 ③目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 ④目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 ⑤缺點(diǎn)：融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：促溶劑 最常用, 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)表面活性劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體的復(fù)性與重折疊：二硫鍵形成（將多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基氧化重新形成二硫鍵（關(guān)鍵））；通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)重折疊形成二硫鍵的方式主要有：A化學(xué)氧化法——需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 B二硫鍵交換——需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好包涵體復(fù)性操作的方法：緩慢降低變性劑濃度，并盡量減低蛋白濃度。包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：①、便于表達(dá)產(chǎn)物分離——包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)②、利于表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在——在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：——以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)形式：a)部分屬于折疊過(guò)程中的產(chǎn)物；b)部分為無(wú)序卷曲與聚集，分子內(nèi)二硫鍵錯(cuò)配。裸露或被膜包裹。 同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因三、大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體：胞內(nèi)高效表達(dá)時(shí)，工程菌因大量合成異源蛋白質(zhì)所形成的水不溶性積聚物。D、質(zhì)?？截悢?shù) 策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個(gè)至數(shù)十個(gè)）amp。噬菌體DNA上的TФ B、二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)C、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） mRNA 5’端非翻譯序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。B、終止子轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象： ，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物。常用原核基因啟動(dòng)子：【lac (乳糖啟動(dòng)子)；trp (色氨酸啟動(dòng)子)；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子——Ptac = Ptrp 的35區(qū)+ Plac的10區(qū)）；T7啟動(dòng)子】——IPTG誘導(dǎo)；PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動(dòng)子)——溫控（熱誘導(dǎo)），30℃/37℃培養(yǎng)， 42℃誘導(dǎo)。原核基因啟動(dòng)子是由兩段彼此分開(kāi)且又高度保守的核苷酸序列組成：（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5—10bp，一般由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T，故又稱(chēng)為T(mén)ATA盒或—10區(qū)。（沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。第三章 大腸桿菌基因工程一、大腸桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)（4405個(gè)ORF），便于基因操作 ，遺傳較穩(wěn)定：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便 4. 被美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的重組藥物生產(chǎn)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)1. 缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等）（形成包涵體），分泌機(jī)制不完善 二、大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)原理①大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的基本元件A、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因 B、轉(zhuǎn)錄元件：?jiǎn)?dòng)子、終止子C、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)D、克隆元件：克隆位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因E、翻譯后元件（非必須） ：信號(hào)肽、融合肽②外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)原理A、啟動(dòng)子 (Promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始RNA合成的序列。：可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫(kù)篩選均需多輪操作步驟。連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體：出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的λDNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類(lèi)）需使用YAC或BAC載體。④化學(xué)合成法（全基因合成）基因文庫(kù)的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率，f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小。②cDNA法基本策略：【cDNA第一鏈的合成→cDNA第二鏈的合成（自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、）】/雙鏈cDNA的克隆 →離目的基因（完備分離程序、特異分離程序、差異分離程序）③PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物基本策略：由Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴(lài)型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門(mén)aq DNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞——如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。在高度分化的生物體中cDNA文庫(kù)的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)基因克隆常用方法：①鳥(niǎo)槍法基本策略：染色體DNA的切斷：超聲波處理——片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端；全酶切——片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開(kāi)，大小不可控；部分酶切——片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為：基因組文庫(kù)（含有全部基因）amp。常規(guī)基因克隆則否。 不同轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化——106 – 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化——105 – 106 / mg DNA λDNA轉(zhuǎn)染——107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化——106 – 109 / mg DNA 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。（ / 2686X660），也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。②電轉(zhuǎn)化法 ③熱激法轉(zhuǎn)化率的定義：每微克DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌能獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)。感受態(tài)細(xì)胞（pentent cell )①CaCl2法原理Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA與其形成抗Dnase的羥基鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)即為感受態(tài)。實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體（宿主）：大腸桿菌；真菌：酵母菌（畢赤酵母，漢森酵母，啤酒酵母）amp。遺傳操作繁瑣。適用于哺乳類(lèi)動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體。F. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO）——與人的親緣關(guān)系近，表達(dá)系統(tǒng)完善，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)。DNA重組操作系統(tǒng)欠完善。適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌。D. 酵母菌——具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定。遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。適用于重組蛋白與多肽、特別是微生物來(lái)源的酶的高效分泌表達(dá)。B. 枯草芽孢桿菌——遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素。適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、基因文庫(kù)的構(gòu)建和外源基因的高效表達(dá)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌。構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)三、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞（1）受體（宿主）應(yīng)具備的條件——外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（h