【正文】 基因工程基礎知識復習歸納作者：日期：基因工程復習歸納第一章 緒論：是指按照人們的愿望，經(jīng)過嚴密的設計，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體/宿主）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳、并表達出新的性狀的技術。：遺傳工程→DNA重組技術→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。應用領域以“基因工程”、“DNA重組”為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達出胰島素1982：世界上第一個基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術誕生1989：我國第一個基因工程藥物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一個基因治療藥物重組腺病毒p53上市基因（供體）：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細胞，并能穩(wěn)定遺傳的DNA分子（克隆載體、表達載體）。宿主（受體）：，能攝取外源DNA、并能使其穩(wěn)定維持的細胞（組織、器官或個體）。（切、接、轉、增、檢（大腸桿菌是中心角色）（1）目的基因的獲取：從復雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。 （2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。 （3）重組體的轉化：將重組體（載體）轉入適當?shù)氖荏w細胞中。 （4）克隆鑒定：挑選轉化成功的細胞克隆（含有目的基因）。 （5）目的基因表達：使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。 第二章 DNA重組克隆的單元操作一、用于核酸操作的工具酶1. 限制性核酸內切酶(主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵)。限制性核酸內切酶的功能與類型主要特征I型II型III型功能限切/修飾限切限切/修飾蛋白結構異源三聚體單體異源二聚體輔助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內距識別序列下游2426bp處其中II型限制性核酸內切酶：切割位點專一，適于DNA重組，是DNA重組中最常用工具酶。特點：、并切割雙鏈DNA分子中特異序列的DNA內切酶。（旋轉對稱結構）。、僅有限制性內切酶活性，無甲基化酶活性。：5’突出末端、3’突出末端、：大多為37℃,適鹽濃度：高鹽、中鹽、低鹽。，識別和切割序列發(fā)生變化（星號反應）。星活性（star activity）：在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星活性。引起星活性的因素： ① 高濃度甘油（5%）、② 酶過量（100U/mg）、③ 低離子強度（25mM）④ 高pH ()、⑤ 有機溶劑、⑥ 用其它二價陽離子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+。 II型限制性核酸內切酶的命名具體規(guī)則是：以生物體屬名的第一個大寫字母和種名的前兩個小寫字母構成酶的基本名稱，如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將株名的一個字母加在基本名稱之后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質粒上，則還需用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子。酶名稱的最后部分為羅馬數(shù)字，表示在該生物體發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。例子：Eschericha（屬名）coli（種名）R （質粒）大腸桿菌R質粒—EcoR I EcoR VHaemophilus（屬名） influenzae（種名） d（株名） 嗜血流感桿菌d株 H i n d II H i n d III。羅馬數(shù)字表示同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶。特殊性質的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又稱異源同序酶或異源同工酶，是指識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶識別相同序列，如HindIII – HsuI: A / AGCTT同尾酶：是指識別位點不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一類酶，如BglII：A / GATCT；BamHI: G / GATCC。同尾酶的切割產(chǎn)物互為粘性末端，并能連接，但連接后二個酶的識別序列均被破壞。（T4DNA連接酶）功能：體外連接ＤＮＡ片段常用的連接酶：Ｔ４ ＤＮＡ連接酶參與連接反應的基團：３端羥基和５端磷酸基團，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的基本性質 ：修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵、修復RNADNA雜合分子中DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵、連接多個平頭雙鏈DNA分子T4 DNA連接酶的活性單位定義：在 20μl 反應體系中于 16℃ ，使 HindⅢ 切過的 l DNA （300μg/ml， 539。 末端）在 30 分鐘內連接 50% 所需的酶量為 1 個 NEB 單位。①大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）基本性質：1. 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 2. 5‘→3‘的核酸外切酶活性 3. 3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶 I 的基本用途： translation 。所有的DNA聚合酶中只有此酶有該反應。缺口平移標記原理見ppt。大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow 酶）：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：1. 補平由核酸內切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端 。②T4DNA聚合酶基本特性：‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性(極強) 2. 在無dNTP時，可以從任何3‘OH端外切 ，聚合活性占主導地位基本用途：’粘性末端，該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多。③依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）基本用途：1. 以RNA為模板合成cDNA鏈 單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）【特異性地從5‘ 端外切】；單鏈核酸內切酶：S1核酸酶【降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5．核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）amp。大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】；T4多核苷酸磷酸激酶（T4PNP）二、用于克隆的載體1. 載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代、擴增或表達的工具。載體應具備的條件： （可轉移性）2. 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或結合位點 3. 具有較高的外源DNA的載裝能力 4. 具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點(多克隆位點 ) 5. 具有合適的篩選標記 ：（1）根據(jù)主要用途可以分為：克隆載體和表達載體①克隆載體：主要用于在大腸桿菌細胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細胞中構建基因文庫?？寺≥d體關鍵元件： ②表達載體：除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達用的啟動子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達目的基因。（2）按傳代特性分：①自主復制型載體：含復制子，可獨立于宿主染色體外復制與傳代（穿梭載體：裝有針對兩種不同受體的復制起點，便于基因克?。?。②整合型載體：不含復制子，需借助同源重組機制整合于宿主基因組。：（1）質粒：15kb以下 嚴緊型復制控制的質粒：1 5 拷貝，如pSC101 松弛型復制控制的質粒：30 50 拷貝，如 ColE1氯霉素擴增：在宿主菌生長的中后期，通過添加氯霉素抑制蛋白質合成、關閉主要代謝途徑，以使松弛型質粒 迅速大量擴增（可達上千拷貝）的操作。質粒載體的特點：分子量小，便于操作；易于構建，可作為其他宿主系統(tǒng)載體的骨架；用途廣泛；缺點：裝載量?。ㄐ∮?0kb），不能用來克隆大片段。重要的大腸桿菌質粒載體：pBR322：松弛型復制；氯霉素可擴增；拷貝數(shù) 50 – 100 / cell；用于基因克隆。還有pUC18/19；T載體，詳見ppt，了解一下。實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA： ① 氯化銫密度梯度離心法：質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染；②堿裂解法（最常用）：質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間；③沸水浴法：質粒DNA純度底、快速、操作簡便。質粒的不相容性的分子機制兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)不同，可導致子代細胞質粒組成不同，且這種差異具隨機性，經(jīng)過若干代后宿主細胞中處于數(shù)量弱勢的質粒必然被淘汰，而僅剩強勢質粒。質粒載體不穩(wěn)定性的類型分離的不穩(wěn)定性：在細胞分裂過程中發(fā)生的質粒不平均的分配，有的細胞沒有獲得質粒 DNΑ拷貝，并最終增殖成為無質粒的優(yōu)勢群體。結構的不穩(wěn)定性：由轉位作用和重組作用所引起的質粒DNΑ的重排與缺失。 影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素新陳代謝負荷對質粒載體穩(wěn)定性的效應；拷貝數(shù)差度對質粒載體穩(wěn)定性的影響——低差度穩(wěn)定 / 高差度不穩(wěn)定；寄主重組體系對質粒載體穩(wěn)定性的效應——形成重組質粒二聚體，便會以高出質粒單體分子兩倍的速度進行復制，從而導致出現(xiàn)質粒寡聚體的克隆增殖。（2）lamda噬菌體DNA:　25kbλ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體，由外殼包裝蛋白和lDNA組成。DNA重組技術一般需要λ噬菌體進入溶菌狀態(tài)λDNA是線性雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸。λDNA兩端各帶有一個12bp的粘性末端，稱為cos位點。噬菌體感染細菌以后，雙鏈DNA分子通過COS位點成環(huán)狀。①插入型載體：改造后的長度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體：cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。2. Lac Z基因插入失活：在l