【正文】 基因工程基礎(chǔ)知識(shí)復(fù)習(xí)歸納作者：日期：基因工程復(fù)習(xí)歸納第一章 緒論：是指按照人們的愿望，經(jīng)過(guò)嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體/宿主）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳、并表達(dá)出新的性狀的技術(shù)。：遺傳工程→DNA重組技術(shù)→分子/基因克?。∕olecular/Gene→基因工程→基因操作。應(yīng)用領(lǐng)域以“基因工程”、“DNA重組”為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達(dá)出胰島素1982：世界上第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術(shù)誕生1989：我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一個(gè)基因治療藥物重組腺病毒p53上市基因（供體）：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細(xì)胞，并能穩(wěn)定遺傳的DNA分子（克隆載體、表達(dá)載體）。宿主（受體）：，能攝取外源DNA、并能使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞（組織、器官或個(gè)體）。（切、接、轉(zhuǎn)、增、檢（大腸桿菌是中心角色）（1）目的基因的獲?。簭膹?fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。 （2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。 （3）重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。 （4）克隆鑒定：挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?。 （5）目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。 第二章 DNA重組克隆的單元操作一、用于核酸操作的工具酶1. 限制性核酸內(nèi)切酶(主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵)。限制性核酸內(nèi)切酶的功能與類型主要特征I型II型III型功能限切/修飾限切限切/修飾蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體單體異源二聚體輔助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM識(shí)別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列GAGCCCAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)距識(shí)別序列下游2426bp處其中II型限制性核酸內(nèi)切酶：切割位點(diǎn)專一，適于DNA重組，是DNA重組中最常用工具酶。特點(diǎn)：、并切割雙鏈DNA分子中特異序列的DNA內(nèi)切酶。（旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)）。、僅有限制性內(nèi)切酶活性，無(wú)甲基化酶活性。：5’突出末端、3’突出末端、：大多為37℃,適鹽濃度：高鹽、中鹽、低鹽。，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化（星號(hào)反應(yīng)）。星活性（star activity）：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星活性。引起星活性的因素： ① 高濃度甘油（5%）、② 酶過(guò)量（100U/mg）、③ 低離子強(qiáng)度（25mM）④ 高pH ()、⑤ 有機(jī)溶劑、⑥ 用其它二價(jià)陽(yáng)離子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+。 II型限制性核酸內(nèi)切酶的命名具體規(guī)則是：以生物體屬名的第一個(gè)大寫字母和種名的前兩個(gè)小寫字母構(gòu)成酶的基本名稱，如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將株名的一個(gè)字母加在基本名稱之后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還需用一個(gè)大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子。酶名稱的最后部分為羅馬數(shù)字，表示在該生物體發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。例子：Eschericha（屬名）coli（種名）R （質(zhì)粒）大腸桿菌R質(zhì)粒—EcoR I EcoR VHaemophilus（屬名） influenzae（種名） d（株名） 嗜血流感桿菌d株 H i n d II H i n d III。羅馬數(shù)字表示同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶。特殊性質(zhì)的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又稱異源同序酶或異源同工酶，是指識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同的不同來(lái)源的酶識(shí)別相同序列，如HindIII – HsuI: A / AGCTT同尾酶：是指識(shí)別位點(diǎn)不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一類酶，如BglII：A / GATCT；BamHI: G / GATCC。同尾酶的切割產(chǎn)物互為粘性末端，并能連接，但連接后二個(gè)酶的識(shí)別序列均被破壞。（T4DNA連接酶）功能：體外連接ＤＮＡ片段常用的連接酶：Ｔ４ ＤＮＡ連接酶參與連接反應(yīng)的基團(tuán)：３端羥基和５端磷酸基團(tuán)，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的基本性質(zhì) ：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵、修復(fù)RNADNA雜合分子中DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵、連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子T4 DNA連接酶的活性單位定義：在 20μl 反應(yīng)體系中于 16℃ ，使 HindⅢ 切過(guò)的 l DNA （300μg/ml， 539。 末端）在 30 分鐘內(nèi)連接 50% 所需的酶量為 1 個(gè) NEB 單位。①大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）基本性質(zhì)：1. 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 2. 5‘→3‘的核酸外切酶活性 3. 3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶 I 的基本用途： translation 。所有的DNA聚合酶中只有此酶有該反應(yīng)。缺口平移標(biāo)記原理見ppt。大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow 酶）：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：1. 補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端 。②T4DNA聚合酶基本特性：‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性(極強(qiáng)) 2. 在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3‘OH端外切 ，聚合活性占主導(dǎo)地位基本用途：’粘性末端，該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多。③依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）基本用途：1. 以RNA為模板合成cDNA鏈 單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）【特異性地從5‘ 端外切】；單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶【降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5．核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）amp。大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】；T4多核苷酸磷酸激酶（T4PNP）二、用于克隆的載體1. 載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體應(yīng)具備的條件： （可轉(zhuǎn)移性）2. 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn) 3. 具有較高的外源DNA的載裝能力 4. 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn) ) 5. 具有合適的篩選標(biāo)記 ：（1）根據(jù)主要用途可以分為：克隆載體和表達(dá)載體①克隆載體：主要用于在大腸桿菌細(xì)胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建基因文庫(kù)?？寺≥d體關(guān)鍵元件： ②表達(dá)載體：除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達(dá)用的啟動(dòng)子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達(dá)目的基因。（2）按傳代特性分：①自主復(fù)制型載體：含復(fù)制子，可獨(dú)立于宿主染色體外復(fù)制與傳代（穿梭載體：裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制起點(diǎn)，便于基因克隆）。②整合型載體：不含復(fù)制子，需借助同源重組機(jī)制整合于宿主基因組。：（1）質(zhì)粒：15kb以下 嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒：1 5 拷貝，如pSC101 松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒：30 50 拷貝，如 ColE1氯霉素?cái)U(kuò)增：在宿主菌生長(zhǎng)的中后期，通過(guò)添加氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成、關(guān)閉主要代謝途徑，以使松弛型質(zhì)粒 迅速大量擴(kuò)增（可達(dá)上千拷貝）的操作。質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：分子量小，便于操作；易于構(gòu)建，可作為其他宿主系統(tǒng)載體的骨架；用途廣泛；缺點(diǎn)：裝載量?。ㄐ∮?0kb），不能用來(lái)克隆大片段。重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：pBR322：松弛型復(fù)制；氯霉素可擴(kuò)增；拷貝數(shù) 50 – 100 / cell；用于基因克隆。還有pUC18/19；T載體，詳見ppt，了解一下。實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA： ① 氯化銫密度梯度離心法：質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染；②堿裂解法（最常用）：質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間；③沸水浴法：質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便。質(zhì)粒的不相容性的分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，可導(dǎo)致子代細(xì)胞質(zhì)粒組成不同，且這種差異具隨機(jī)性，經(jīng)過(guò)若干代后宿主細(xì)胞中處于數(shù)量弱勢(shì)的質(zhì)粒必然被淘汰，而僅剩強(qiáng)勢(shì)質(zhì)粒。質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，有的細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒 DNΑ拷貝，并最終增殖成為無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNΑ的重排與缺失。 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素新陳代謝負(fù)荷對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)；拷貝數(shù)差度對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響——低差度穩(wěn)定 / 高差度不穩(wěn)定；寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)——形成重組質(zhì)粒二聚體，便會(huì)以高出質(zhì)粒單體分子兩倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖。（2）lamda噬菌體DNA:　25kbλ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體，由外殼包裝蛋白和lDNA組成。DNA重組技術(shù)一般需要λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)λDNA是線性雙鏈DNA分子，全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸。λDNA兩端各帶有一個(gè)12bp的粘性末端，稱為cos位點(diǎn)。噬菌體感染細(xì)菌以后，雙鏈DNA分子通過(guò)COS位點(diǎn)成環(huán)狀。①插入型載體：改造后的長(zhǎng)度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體：cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。2. Lac Z基因插入失活：在l