【正文】 什么是限制性?xún)?nèi)切酶？可劃為哪幾個(gè)類(lèi)型？識(shí)別序列有結(jié)構(gòu)特點(diǎn)？限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)能夠特異性識(shí)別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識(shí)別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)序列的長(zhǎng)度一般為48個(gè)堿基，最常見(jiàn)的為6個(gè)堿基，且具有回文序列的DNA片段，主要產(chǎn)生539。、339。突出的黏性末端或平末端。當(dāng)一個(gè)樣本DNA被一個(gè)特定的限制酶切割后，可以產(chǎn)生一批相同的堿基序列的DNA片段，進(jìn)而可以被用于基因重組、克隆、核酸分子雜交和序列分析等。10. 簡(jiǎn)述質(zhì)粒的基本性質(zhì)？（1）質(zhì)粒的復(fù)制：質(zhì)粒含有復(fù)制起始區(qū)和復(fù)制調(diào)控原件?？蓪?shí)現(xiàn)自主復(fù)制（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：質(zhì)粒分為嚴(yán)謹(jǐn)性和松弛型，因而拷貝數(shù)不同（3）質(zhì)粒的不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒不能共存于同一個(gè)宿主細(xì)胞（4）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：通過(guò)細(xì)菌的接合作用，質(zhì)?？梢员晦D(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞中11. DNA聚合酶有哪些種類(lèi)？各有什么活性？大腸桿菌DNA聚合酶I: 5‘3’ DNA 聚合酶活性 5‘339。 DNA外切核酸酶活性 339。539。 DNA外切酶活性Klenow酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。539。 DNA外切酶活性T4 DNA聚合酶:3’5’DNA外切酶活性T7 DNA聚合酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。539。 DNA外切酶活性（強(qiáng)）反轉(zhuǎn)錄酶:5’→3’ DNA聚合酶活性5‘339。 RNA外切核酸酶活性 339。539。RNA外切酶活性12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后，檢測(cè)目的基因是否表達(dá)的第一個(gè)步驟就是篩選。方法：（1）抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 （2）b半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 第三章1. 作為一個(gè)最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？ (1) 具有復(fù)制起點(diǎn)，可在宿主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制。(2) 具有抗菌素抗性基因，便于篩選。(3) 具若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)，可以進(jìn)行特異性酶切。(4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，便于制備。2. 何為α互補(bǔ)，其基本原理是什么？在載體構(gòu)建中有何作用？α互補(bǔ)（αplementation）：是指lacZ基因上缺失近操作子基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操作子基因區(qū)段的β半乳糖苷酶基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。α互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷β半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的β半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。3. 藍(lán)白斑篩選的原理大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β半乳糖苷酶。lacZ△M15 基因是編碼缺失了β半乳糖苷酶中第1141 個(gè)氨基酸的lacZ 基因無(wú)酶學(xué)活性。對(duì)于只編碼N端140 個(gè)氨基酸的lacZ 基因（稱(chēng)為lacZ′) ，其產(chǎn)物也沒(méi)有酶學(xué)活性。這兩個(gè)無(wú)酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù)β半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的β半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15 放在F 質(zhì)粒上,隨宿主傳代； lacZ ’放在載體上, 作為篩選標(biāo)記。4. 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問(wèn)題？(1)較大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌體擴(kuò)增過(guò)程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長(zhǎng)的噬菌體更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)所致。(2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類(lèi)型的分子(尤其是雙鏈分子)比較費(fèi)力，同時(shí)由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失，培養(yǎng)時(shí)間不能長(zhǎng)，故所得DNA的量有限。(3)重組中，經(jīng)常出現(xiàn)一些能以?xún)煞N可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNA片段的情況，這是因?yàn)橥庠碊NA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致。5. 解釋下列名詞: 基因工程載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞(host cell)、酵母的質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA的衍生物等，經(jīng)過(guò)改造都可以成為載體。插入失活：通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA 片段插入tetr 基因后，導(dǎo)致tetr 基tet tet 因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。琥珀突變：在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱(chēng)這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA），或琥珀突變（突變?yōu)閁AG），或乳白突變（突變?yōu)閁GA）。噬菌粒: 在質(zhì)粒中插入絲狀噬菌體的主要基因區(qū)域()，構(gòu)成一種特殊的質(zhì)粒載體，其基因區(qū)包括： 。(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴(kuò)增。？遺傳學(xué)特性：基因II基因突變，由G變?yōu)門(mén)。突變的基因II產(chǎn)物減弱了與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的作用。生物學(xué)功能：當(dāng)與噬菌粒載體共同存在于宿主細(xì)胞時(shí)M13KO7表達(dá)后的基因產(chǎn)物優(yōu)先作用于噬菌粒，使其進(jìn)行單鏈復(fù)制。第四章1. 大容量克隆載體有哪些種類(lèi)，各有何特點(diǎn)？黏粒載體（cosmid）；酵母人工染色體載體（YAC）；細(xì)菌人工染色體載體(BAC)； P1噬菌體載體(P1)；P1人工染色體載體(PAC)2. 簡(jiǎn)述黏粒、YAC、BAC克隆載體基本構(gòu)成元件。黏粒：質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ColE1）、抗性標(biāo)記（ampr）、cos位點(diǎn)。YAC：自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere, CEN）和兩個(gè)端粒（TEL）。BAC：復(fù)制單元的特殊性:來(lái)自F質(zhì)粒，包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS，啟動(dòng)DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）以及3個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷貝性可以減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。標(biāo)記基因:氯霉素抗性基因3. 黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)（1）同時(shí)具有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特性（2）具有高容量的克隆能力缺（1）兩個(gè)粘粒之間，當(dāng)存在同源序列時(shí)，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。（2）含不同重組DNA的菌落生長(zhǎng)速度不一。當(dāng)柯斯質(zhì)粒文庫(kù)復(fù)制擴(kuò)增時(shí)，由于不同的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞作用的情況不同，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)各種外源DNA片段間的比例失調(diào)。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。（3）包裝蛋白制備過(guò)程較復(fù)雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。而且，購(gòu)買(mǎi)包裝蛋白的費(fèi)用較高。5. 簡(jiǎn)述P1噬菌體載體的基本構(gòu)成元件。⑴ 復(fù)制元件：質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子⑵ 環(huán)化和包裝信號(hào)：2個(gè)loxP重組位點(diǎn)和包裝識(shí)別