【正文】 什么是限制性內(nèi)切酶？可劃為哪幾個類型？識別序列有結(jié)構(gòu)特點？限制性核酸內(nèi)切酶是由細菌產(chǎn)生的一類能夠特異性識別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。限制酶的識別和切割位點序列的長度一般為48個堿基，最常見的為6個堿基，且具有回文序列的DNA片段，主要產(chǎn)生539。、339。突出的黏性末端或平末端。當一個樣本DNA被一個特定的限制酶切割后，可以產(chǎn)生一批相同的堿基序列的DNA片段，進而可以被用于基因重組、克隆、核酸分子雜交和序列分析等。10. 簡述質(zhì)粒的基本性質(zhì)？（1）質(zhì)粒的復制：質(zhì)粒含有復制起始區(qū)和復制調(diào)控原件?？蓪崿F(xiàn)自主復制（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：質(zhì)粒分為嚴謹性和松弛型，因而拷貝數(shù)不同（3）質(zhì)粒的不相容性：兩個質(zhì)粒不能共存于同一個宿主細胞（4）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：通過細菌的接合作用，質(zhì)粒可以被轉(zhuǎn)移到新宿主細胞中11. DNA聚合酶有哪些種類？各有什么活性？大腸桿菌DNA聚合酶I: 5‘3’ DNA 聚合酶活性 5‘339。 DNA外切核酸酶活性 339。539。 DNA外切酶活性Klenow酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。539。 DNA外切酶活性T4 DNA聚合酶:3’5’DNA外切酶活性T7 DNA聚合酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。539。 DNA外切酶活性（強）反轉(zhuǎn)錄酶:5’→3’ DNA聚合酶活性5‘339。 RNA外切核酸酶活性 339。539。RNA外切酶活性12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？重組DNA導入受體細胞后，檢測目的基因是否表達的第一個步驟就是篩選。方法：（1）抗藥性標記及其插入失活選擇法 （2）b半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 第三章1. 作為一個最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？ (1) 具有復制起點，可在宿主細胞中進行獨立復制。(2) 具有抗菌素抗性基因，便于篩選。(3) 具若干限制酶單一識別位點，可以進行特異性酶切。(4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，便于制備。2. 何為α互補，其基本原理是什么？在載體構(gòu)建中有何作用？α互補（αplementation）：是指lacZ基因上缺失近操作子基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操作子基因區(qū)段的β半乳糖苷酶基因的突變體之間實現(xiàn)互補。α互補是基于在兩個不同的缺陷β半乳糖苷酶之間可實現(xiàn)功能互補而建立的。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個堿基對的多克隆位點），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。若在該DNA 小片段中再插入一個大片段，導致產(chǎn)生無α互補能力的β半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。3. 藍白斑篩選的原理大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β半乳糖苷酶。lacZ△M15 基因是編碼缺失了β半乳糖苷酶中第1141 個氨基酸的lacZ 基因無酶學活性。對于只編碼N端140 個氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ′) ，其產(chǎn)物也沒有酶學活性。這兩個無酶學活性的產(chǎn)物混合在一起時，可恢復β半乳糖苷酶的活性，實現(xiàn)基因內(nèi)互補。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個堿基對的多克隆位點），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。若在該DNA 小片段中再插入一個大片段，導致產(chǎn)生無α互補能力的β半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15 放在F 質(zhì)粒上,隨宿主傳代； lacZ ’放在載體上, 作為篩選標記。4. 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問題？(1)較大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌體擴增過程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長的噬菌體更具競爭優(yōu)勢所致。(2)單鏈載體分子感染的細胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類型的分子(尤其是雙鏈分子)比較費力，同時由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失，培養(yǎng)時間不能長，故所得DNA的量有限。(3)重組中，經(jīng)常出現(xiàn)一些能以兩種可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNA片段的情況，這是因為外源DNA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致。5. 解釋下列名詞: 基因工程載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞(host cell)、酵母的質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA的衍生物等，經(jīng)過改造都可以成為載體。插入失活：通過插入失活進行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標記。當外源DNA 片段插入tetr 基因后，導致tetr 基tet tet 因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。琥珀突變：在基因的編碼區(qū)中，若某個密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA），或琥珀突變（突變?yōu)閁AG），或乳白突變（突變?yōu)閁GA）。噬菌粒: 在質(zhì)粒中插入絲狀噬菌體的主要基因區(qū)域()，構(gòu)成一種特殊的質(zhì)粒載體，其基因區(qū)包括： 。(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴增。？遺傳學特性：基因II基因突變，由G變?yōu)門。突變的基因II產(chǎn)物減弱了與自身攜帶的噬菌體復制起點的作用。生物學功能：當與噬菌粒載體共同存在于宿主細胞時M13KO7表達后的基因產(chǎn)物優(yōu)先作用于噬菌粒，使其進行單鏈復制。第四章1. 大容量克隆載體有哪些種類，各有何特點？黏粒載體（cosmid）；酵母人工染色體載體（YAC）；細菌人工染色體載體(BAC)； P1噬菌體載體(P1)；P1人工染色體載體(PAC)2. 簡述黏粒、YAC、BAC克隆載體基本構(gòu)成元件。黏粒：質(zhì)粒復制起點（ColE1）、抗性標記（ampr）、cos位點。YAC：自主復制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere, CEN）和兩個端粒（TEL）。BAC：復制單元的特殊性:來自F質(zhì)粒，包括嚴謹型控制的復制區(qū)oriS，啟動DNA復制的由ATP驅(qū)動的解旋酶（RepE）以及3個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷貝性可以減小外源基因的表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒副作用。標記基因:氯霉素抗性基因3. 黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點？優(yōu)（1）同時具有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特性（2）具有高容量的克隆能力缺（1）兩個粘粒之間，當存在同源序列時，可能會發(fā)生重組，結(jié)果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。（2）含不同重組DNA的菌落生長速度不一。當柯斯質(zhì)粒文庫復制擴增時，由于不同的插入片段對宿主細胞作用的情況不同，結(jié)果會出現(xiàn)各種外源DNA片段間的比例失調(diào)。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。（3）包裝蛋白制備過程較復雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。而且，購買包裝蛋白的費用較高。5. 簡述P1噬菌體載體的基本構(gòu)成元件。⑴ 復制元件：質(zhì)粒復制子和裂解性復制子⑵ 環(huán)化和包裝信號：2個loxP重組位點和包裝識別