基因工程復(fù)習(xí)總結(jié)(已修改)
2025-08-17 22:37 本頁面
【正文】 總結(jié)第一章1. 簡(jiǎn)述基因操作、基因重組和基因工程的關(guān)系?；虿僮? 對(duì)基因進(jìn)行分離、分析、改造、檢測(cè)、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱?；蚬こ?專指為實(shí)踐應(yīng)用而進(jìn)行的基因重組事件，產(chǎn)生的基因工程體可以用作生物反應(yīng)器，或改變了生物性狀的工程體等。基因工程（基因操作）：主要是利用DNA 重組技術(shù)，將生物的某個(gè)基因或一個(gè)DNA片段通過基因載體（DNA載體）運(yùn)送到另一生物的活性細(xì)胞中，然后經(jīng)過克隆（clone）和行使正常功能（表達(dá)），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)分子技術(shù)（從細(xì)菌到高等生物）。2. 為什么說基因工程是生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展的必然產(chǎn)物？（1）基因的提出與基因和DNA關(guān)系的建立，為基因重組打下物質(zhì)基礎(chǔ)（2）DNA結(jié)構(gòu)的闡明和DNA在生命活動(dòng)中作用的認(rèn)識(shí)，為基因操作打下了理論基礎(chǔ)（3）基因操作技術(shù)的發(fā)展直接導(dǎo)致基因工程的誕生和發(fā)展（4）人們研究的熱情和對(duì)基因工程產(chǎn)品的迫切需求，進(jìn)一步推動(dòng)了基因工程的快速發(fā)展3. 簡(jiǎn)述基因的結(jié)構(gòu)組成對(duì)基因操作的影響。(1)．基因及其產(chǎn)物的共線性 (2)．基因及其產(chǎn)物的非共線性(3)．基因的重疊與基因的可變性 (4)．啟動(dòng)子和終止子4. 重組DNA技術(shù)包括哪些步驟分分離制備目的基因切切割目的基因和載體接目的基因與載體連接轉(zhuǎn)將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩篩選并檢定含有重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆表克隆基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)5. 基因工程的流程目的基因的分離制備→與載體體外重組→遺傳轉(zhuǎn)化→轉(zhuǎn)化子篩選→提取目的基因→測(cè)序 ↓獲得優(yōu)良品種 ←表達(dá)特定蛋白產(chǎn)物←導(dǎo)入宿主細(xì)胞←將目的基因克隆到表達(dá)載體(1)限制性核酸內(nèi)切酶：在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割(2)DNA連接酶：將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個(gè)整體(3)DNA聚合酶I：通過向3’端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性(4) Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。(5)反轉(zhuǎn)錄酶:以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈(6)DNA末端轉(zhuǎn)移酶:將寡聚物尾巴加到了線性雙鏈或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端(7)堿性磷酸酶:去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團(tuán)(8)降解酶S1:降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時(shí)也可切割雙鏈核酸分子的單鏈(9)Taq DNA 聚合酶：能在高溫（72℃）下以單鏈DNA為模板，從5’→3’方向合成新的互補(bǔ)鏈。（10）多核苷酸激酶：催化將把一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸鏈的5’－OH末端上（11）核酸外切酶III:降解DNA3’－OH末端的核苷酸殘基（12）脫氧核糖核酸酶：內(nèi)切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA7. 常用的目的基因的獲取方法 構(gòu)建基因組文庫；構(gòu)建cDNA文庫；人工合成DNA技術(shù)；PCR擴(kuò)增8. 堿裂解法提取質(zhì)粒原理高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大，不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。9. 常用的目的基因與載體的連接方法（1）黏性末端連接：將靶基因DNA片段和載體DNA經(jīng)過相同的限制酶進(jìn)行切割，使他們兩端產(chǎn)生相同的黏性末端，然后經(jīng)黏性末端堿基配對(duì)和DNA連接酶的作用，共價(jià)連接成為新的重組DNA分子。（2）平頭末端連接:將平末端的DNA分子在T4連接酶的作用下，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵相互連接。（3）人工接頭法：利用人工接頭加在平端的DNA片段的兩端，然后用相應(yīng)的限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶有相同黏性末端的載體進(jìn)行連接。（4）同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，在線性載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾，而在目的基因的分子兩端加上dC多聚尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶I或) Klenow DNA聚合酶填補(bǔ)裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。第二章1. 什么是細(xì)菌的限制－修飾系統(tǒng)，其功能是什么？細(xì)胞中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細(xì)胞中有限制—修飾系統(tǒng)(RMRestrictionmodification system)。RM系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。限制作用就是限制酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定性的機(jī)制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A 成為N6 甲基腺膘呤，胞嘧啶C 成為5‘ 甲基胞嘧啶。修飾作用是通過甲基化酶來的甲基化作用，是宿主細(xì)胞能識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的機(jī)制。2. 說明限制性內(nèi)切核酸酶命名原則（舉例）。3. 限制內(nèi)切核酸酶的星活性是指什么？星星活性（star activity）:在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。4. T4 DNA ligase ligase 有什么異同？同：(1)催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。(2)反應(yīng)底物為粘端、切口、平端的RNA或DNA。(3)低濃度的聚乙二醇PEG（一般為10%）和單價(jià)陽離子（150200 mM NaCl）可以提高平端連接速率。(4)℃反應(yīng)，大約需4小時(shí)；若在4℃反應(yīng)，則需反應(yīng)過夜。不同： ligase需NAD+參與，且其平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA。作cDNA克隆時(shí)，不會(huì)將RNA連接到DNA，不連接RNA。5. 連接酶的反應(yīng)溫度如何選擇，為什么？連接酶最適的反應(yīng)溫度應(yīng)是37℃。但在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，溫度過高，雖然酶反應(yīng)速度快，但是連接斷開是雙向的，動(dòng)態(tài)平衡，可能由于熱運(yùn)動(dòng)的關(guān)系，斷開速度也快，溫度過低，連接速度太慢。4度過夜也是有很高的連接效率。因此連接反應(yīng)常采用的最佳溫度一般在416℃間，通常多選用1216℃ 30分鐘到16小時(shí)。6. 什么是Klenow酶？有什么作用？Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenow frgment）， DNA聚合酶Ⅰ大片段（ DNA polymeraseⅠlargefragment）。Klenow DNA聚合酶作用① 補(bǔ)平3′凹端，如果使用帶標(biāo)記的dNTP，則可對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。② 抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性③ 通過置換反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記④ 在cDNA克隆中合成第二鏈⑤ 隨機(jī)引物標(biāo)記⑥ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA7. 分子克隆的基本流程 8.
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