基因工程簡答題總結(jié)(編輯修改稿)
2024-09-01 20:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 AC 文庫的代表性。(4) YAC 結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似，使用常規(guī)方法不易將YAC 和酵母天然染色體分開。(5) 構(gòu)建好的YAC 轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。(6) 建好庫后保存方便，但要篩選某個(gè)基因時(shí)工作量大 6．什么是 BAC？BAC 載體的組成與優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？①細(xì)菌人工染色體（BAC）是從大腸桿菌F 因子改造構(gòu)建而來的，能夠攜帶大約300kb 的DNA 插入片段。②載體具有 F 因子的復(fù)制起始點(diǎn)（oriS），可使載體維持每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝的水平。 ③載體包括有 4 個(gè)維持DNA 復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因，repE, parA, parB and parC。④具有一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記基因，和lacZ’基因。在lacZ’基因中組裝有一多克隆位點(diǎn)，便于外源片段的插入和藍(lán)白反應(yīng)篩選克隆子。⑤插入的 DNA 片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)百代，而且不易發(fā)生重組和從寄主細(xì)胞中丟失。⑥主要缺點(diǎn)是每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)少（1~2 個(gè)），使得分離和篩選較為困難。7．利用pBR322 質(zhì)粒插入失活分離帶有外源DNA 片段的重組克隆的原理是什么？①外源 DNA 片段插入在pBR322 質(zhì)粒tetr基因的編碼序列內(nèi)（BamHI）位點(diǎn)，使該基因失活；②體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ampstets菌株，并涂布在amp 瓊脂平板上，凡獲得了pBR322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒(AmprTets)的寄主細(xì)胞都可長成菌落；③將 amp 瓊脂上的菌落原位影印在tet瓊脂平板上生長，對比這兩個(gè)平板的菌落生長情況，凡在amp平板上能夠生長而在tet平板上不能生長的菌落，便是屬于帶有重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克?。惶舫鲞@樣的陽性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA 插入片段的重組體質(zhì)粒。8. pUC質(zhì)粒利用α互補(bǔ)作用篩選重組子原理是什么？答：pUC系列質(zhì)粒載體是在pBR322 質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來的，它用lacZ’基因取代了pBR322質(zhì)粒載體上的tetr基因。lacZ’基因編碼β半乳糖苷酶的N 末端163 個(gè)氨基酸(α肽鏈)的DNA 片段, 在lacZ’基因內(nèi)組入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），但不影響lacZ’基因的功能。pUC載體的宿主（E. coli）攜帶一個(gè)編碼β半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它們本身用這個(gè)基因片段產(chǎn)生的β半乳糖苷酶片段是無活性的, 但它們可以通過α互補(bǔ)作用在體內(nèi)相互彌補(bǔ), 即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的β半乳糖苷酶。當(dāng)pUC質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含有指示劑Xgal 和 IPTG 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落成藍(lán)色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破壞了lacZ’基因的功能（插入失活），不再產(chǎn)生α肽鏈，不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的β半乳糖苷酶，形成的菌落是無(白)色的。因此，根據(jù)這種β半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測出含有外源DNA 插入序列的重組體克隆。9．自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多，即使是ColE1 和pSCl01 這兩個(gè)自然質(zhì)粒也不盡如人意，通常需要進(jìn)行改造。請問質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容?答：基本內(nèi)容包括：(1) 刪除一些非必要的區(qū)段及對宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載體具有更大的容納外源片段的能力。(2) 加上易于選擇或檢測的標(biāo)記。(3) 限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的改造，便于外源基因插入到載體中的特定位置。(4) 加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達(dá)。(5) 安全性改造，限定載體的宿主范圍。 10．質(zhì)粒制備的基本原理？答：帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞在SDS 作用下裂解，并在堿性條件下使DNA 變性。調(diào)節(jié)pH 值至中性時(shí)質(zhì)粒DNA 首先復(fù)性，而細(xì)菌基因組DNA 不能復(fù)性而與SDS蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，可以被離心沉淀除去。上清液中的質(zhì)粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀純化出來。四、問答題1．λ噬菌體DNA 被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件？為什么？答：①兩個(gè)cos位點(diǎn)；②線性DNA；③分子大小在λ噬菌體基因組的75%～105%。2．為什么野生型的λ噬菌體DNA 不宜作為基因工程載體?答：(1) 噬菌體DNA 沒有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對DNA 包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將λ噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大??；(2) 野生型的λDNA 對于一些常用的酶都有多個(gè)識別和切割位點(diǎn)，不便于克??；(3) 沒有可供選擇的標(biāo)記；(4) 野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。4．λ噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足?答：優(yōu)點(diǎn)：(1) λ基因組中有1／3 的非必需區(qū)可以被置換。改造成載體后，克隆的片段較大(可達(dá)20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個(gè)kb；(2) 用噬菌體λDNA 作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；(3) λ可通過溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，可讓它以溶原性存在，若要表達(dá)，可通過誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA 的拷貝數(shù)就會很多。缺點(diǎn)：(1) 包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費(fèi)用高；(2) 沒有質(zhì)粒的用途廣泛。5．以置換型λ噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組體? 答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過入基因組的105％，不能小于又基因組的75％。以置換型λ噬菌體DNA 作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源DNA 重組。如果沒有外源片段，僅是兩臂連接，長度短于久基因組的75％，不能被包λ噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長度超過λ基因組105％后，也不能包入噬菌體顆粒，自然也不能形成噬菌斑。6．M13 系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?答：M13 克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：(1) 克隆的片段大：M13 噬菌體的DNA 在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大。有報(bào)道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA 長6～7 倍的 DNA(插入片段可達(dá)40kb)。(2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對于DNA 測序、DNA 誘變、制備特異的單鏈DNA 探針都是十分有用的。(3) 單鏈DNA 和雙鏈DNA 都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。 M13 克隆系列的不足：(1) 較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過程中往往不夠穩(wěn)定。一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的概率越大。(2) 單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。 7．黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?答：主要特點(diǎn)有：①柯斯質(zhì)粒是含有λ噬菌體 COS 位點(diǎn)的質(zhì)粒載體?？滤官|(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。②具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。③插入片段的消化、連接及后來重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。④具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞不同，重組體像λ載體一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)菌。⑤包裝后形成的λ顆粒用來感染大腸桿菌，重組DNA 像λ DNA 一樣注入細(xì)菌細(xì)胞，并以COS位點(diǎn)環(huán)化。由于缺乏λ的其他DNA 序列，環(huán)化DNA 在細(xì)菌體內(nèi)以質(zhì)粒一樣維持。 ⑥簡化了篩選。載體體積小，承載外源 DNA 片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb
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