基因工程簡答題總結(jié)(已修改)
2025-08-17 20:45 本頁面
【正文】 基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題 簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時(shí)切割。同裂酶：識別序列相同，切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶 （PS：完全同裂酶：識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。不完全同裂酶：識別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。） 連接酶主要有哪些類型？有何異同點(diǎn)？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？ 類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點(diǎn)：相同點(diǎn)：都能以DNA為模板，從5’向3’進(jìn)行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。不同點(diǎn)：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。 試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網(wǎng)上答案）低溫下長時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好。在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。足夠多的載體和插入片段是最重要的。平端的連接對于離子濃度很敏感盡可能縮小連接反應(yīng)的體積建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修飾過的T7 DNA聚合酶6）逆轉(zhuǎn)錄酶7）Taq DNA聚合酶 第四章 基因克隆的載體系統(tǒng) 作為基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件？具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；具有合適的篩選標(biāo)記；具有較高的外源DNA的載裝能力；具有多克隆位點(diǎn)（MCS）；具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？A、 化學(xué)法（CaCl2法)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。B、 電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場，在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素:1）載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2）插入片段的大小：插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低；3）受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理；4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類型：（1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測法在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。（2）基于克隆DNA序列檢測法Southern印跡雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。 第五章基因的克隆一般方法基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RTPCR和SSH，原因請看下題）？1）差減雜交（SH）通過DNA復(fù)性動力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫的方式來進(jìn)行目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。3）差異顯示PCR（DD RTPCR）利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計(jì)象5`T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5`端的隨機(jī)引物（20條10mer），可以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。4）DNA代表性差異分析（DNA RDA）代表性差別分析是通過突變型（驅(qū)趕DNA，driver DNA）與野生型（檢測DNA，tester DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴(kuò)增限制性片段長度多樣性（AFLP）基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識別粘性末端，互補(bǔ)連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。[簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)，有何應(yīng)用？主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計(jì)象5`T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5`端的隨機(jī)引物（20條10mer），可以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：l 簡便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。l 所需的mRNA量少。l 各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行比較。l 擴(kuò)出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。缺點(diǎn)：l 假陽性條帶多，對低豐度的基因表達(dá)不容易檢測。l 工作量大。l 無法定量研究。l 擴(kuò)出的條帶往往是3`端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221） 抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。 應(yīng)用：l 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；l 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；l 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。 酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。A．酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分隔開的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是DNA特異結(jié)合域（DNAbinging domain,BD），一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的、具有激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基
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