【正文】 BR322 在大腸桿菌中的拷貝數(shù)達(dá)到 20 個(gè)。只有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能生長(zhǎng)，因?yàn)?pBR322 有 Apr 基因和 Tcr 基因。 四環(huán)素抗性基因中有 BamHI 和 SalI 兩個(gè)克隆位點(diǎn)，插入滅活。雙抗生素標(biāo)記（負(fù)篩選法） 3 pUC 系列載體有三點(diǎn)與 pBR 系列載體不同：一是 pUC 載體較小，全長(zhǎng)僅 2686 bp； copy 2020～ 3000/cell；二是只保留了一個(gè)藥物抗性基因 Apr，另一個(gè)標(biāo)記基因是β 半乳糖苷酶基因，該基因是一個(gè)生化標(biāo)記基因，極易檢測(cè)，（正篩選法）；三 是有一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，共有10 個(gè)克隆位點(diǎn)，極有利于克隆外源基因。 3 藍(lán)白斑形成 ： pUC 質(zhì)粒載體上的 lacZ 編碼α肽與大腸桿菌的 LacZ△ M15 編碼的缺失突半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成 4 聚體，又能分解 Xgal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，形成藍(lán)色菌落。不能互補(bǔ)，因此形成 白色菌落 。 4 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒載體 4 野生型根癌農(nóng)桿菌的 Ti 質(zhì)?？筛鶕?jù)其產(chǎn)生的冠癭堿類(lèi)型分為：章魚(yú)堿類(lèi)，胭脂堿類(lèi)、農(nóng)桿堿型和琥珀堿類(lèi)等。 4 Ti質(zhì)粒的結(jié) 構(gòu)： Ti質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀 DNA 分子，其長(zhǎng)度為 160250 kb； 4 Ti有 5 個(gè)功能區(qū)：（ 1) TDNA 區(qū)： 12 24 kb （ 2)冠癭堿分解區(qū)；（ 3)毒性區(qū)（ Vir）； （ 4)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū) (tra/con)；（ 5)DNA 復(fù)制區(qū)（ Rep）。 vir 基因產(chǎn)物將 Ti質(zhì)粒上的 TDNA 單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈 TDNA 結(jié)合形成復(fù)合物， 后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。第三套基因 Onc 基因合成冠癭堿。 4在致癌區(qū)和冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個(gè) 25 bp 直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA 區(qū)域叫做 TDNA (transfer DNA) ，插入植物染色體中的 Ti 質(zhì)粒片段只有 TDNA。 4毒性區(qū)（ Vir）的基因只能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物參與 TDNA 從 Ti質(zhì)粒中脫落出來(lái)，然后再將其轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中并整合到植物染色體中。 50、取代型 Ti質(zhì)?？寺≥d體：用大腸桿菌質(zhì)粒載體取代野生型 Ti質(zhì)粒的全部或部分 TDNA核苷酸序列，而構(gòu)建成取代型 Ti質(zhì)粒克隆載體。 Onc－載體叫“卸甲載體” 5 PGV3851 Onc+載體：一種是 PGV3851 載體，它的 TDNA 區(qū)段中的缺失范圍比 pGV3850的要小，其左側(cè)的核心區(qū)已經(jīng)缺失并被 PBR322 取代，但右側(cè)的核心區(qū) (包括 Tmr 基因內(nèi) )則仍然保留著，這種質(zhì)粒形成不依賴(lài)于植物激素的芽性突變體。 53：中間質(zhì)粒 克隆載體： TDNA 的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體中，由此構(gòu)建的克隆載體承載外源基因后，須先在輔助質(zhì)粒或卸甲載體的推動(dòng)下進(jìn)入農(nóng)桿菌，再在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下送入植物細(xì)胞。 5 共整合克隆載體系統(tǒng)中間克隆載體特征：中間載體必須含有與 Ti質(zhì)粒 TDNA 區(qū)同源的序列，此外含有 pBR 的序列，在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與 Ti質(zhì)粒的 TDNA 的同源序列進(jìn)行重組；它應(yīng)具有幾個(gè)細(xì)菌篩選標(biāo)記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒；它必須具有bom 位點(diǎn)，在有誘 導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下， bom 位點(diǎn)的存在可以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；它應(yīng)該含有陽(yáng)性植物選擇標(biāo)記，以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移的基因，其可賦子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性； 無(wú) Ti質(zhì)粒的邊界序列（缺 LTS 和 RTS） 5 植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)：首先在 中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與受體 Ti 質(zhì)粒（卸甲載體）上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti 質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。 5 ）植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化 的雙元系統(tǒng)：目前 TDNA 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有 Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng) Ti質(zhì)粒上的 Vir 基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的TDNA 切割下來(lái)，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。 60、 攜帶外源基因的是微型 Ti質(zhì)粒 (MiniTi plasmid)，它在 T－ DNA 左右邊界序列之間提供植株選擇標(biāo)記。酵母 2181。 6 酵母菌中的野生型質(zhì)粒：酵母 2181。啤酒酵母中 2181。 2181。含有 2181。酵母的 2μ m 質(zhì)粒不授予宿主任何表型效應(yīng)，也屬于隱秘型質(zhì)粒。m 質(zhì)粒有兩個(gè) 599bp 的反向重復(fù)序列，分子內(nèi)和分子間重組發(fā)生在這段反向重復(fù)順序上，重組的結(jié)果使 2181。m 質(zhì)粒有三個(gè)功能區(qū)： (1)ori(復(fù)制序列 )，它是 2181。 (2) REP，具有控制 2181。 (3) FLP 功能區(qū)， FLP 基因編碼一個(gè)較大的蛋白，與質(zhì)粒重組有關(guān)。m 質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱(chēng)為 YEp；由細(xì)菌質(zhì)粒和酵母 2181。重組構(gòu)建的質(zhì)粒在酵母和大腸桿菌中能很好復(fù)制。 YEP這些特性使它成為構(gòu)建表達(dá)型載體的很好的骨架系統(tǒng)。 ARS 為酵母菌染色體中的自主復(fù)制序列， 。g DNA)。 6 YIP（ 整合型酵母質(zhì)粒）：由細(xì)菌質(zhì)粒和一段不含有 ARS 的酵母 染色體 DNA 組成，即含有酵母菌染色體 DNA 同源序列。 YIP 轉(zhuǎn)化頻率較低，約為 1— 10轉(zhuǎn)化體 181。 YIP 常用來(lái)研究酵母基因的定位，分離與基因調(diào)控。用線性質(zhì)粒，其 5’端各帶一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺嘧啶核苷 （ T），與 PCR產(chǎn)物以 TA 方式連接，而直接重組，即 TA 克隆。 第二章 （基因克隆載體 —— 噬菌體） 病毒顆粒： DNA 或 RNA＋外殼蛋白；核酸的復(fù)制和外殼蛋白的合成，是利用宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)完成的。 噬菌體克隆載體：λ噬菌體由外殼包裝蛋白和 lDNA 組成；線狀雙鏈 DNA， 48502bp 兩端各有 12 個(gè)核苷酸組成的 5’凸出互補(bǔ)粘性末端（ cos 位點(diǎn)）。 噬菌體載體構(gòu)建的基本策略：切去非必須區(qū)；抹去多余的酶切點(diǎn)；插入篩選標(biāo)記基因；建立體外包裝系統(tǒng)。 b. λ DNA 進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞容易，它不需要象質(zhì)粒載體那樣需要采用化學(xué) 介導(dǎo)法才能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞； （溶菌斑），因而不管是提取λ載體 DNA或重組λ DNA 都比較容易； DNA 或 cDNA 文庫(kù)易于長(zhǎng)期保存。 取代（置換）型載體：兩個(gè) MCS 以反向重復(fù)形式分別位于 DNA 的非必須區(qū)兩端。 載體克隆原理及步驟：結(jié)合λ包裝過(guò)程 1．通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體回收、純化載體； 2．酶切、載體與外源 DNA 3．連接 4．包裝λ溶原菌株 (BHB2688+BHB2690)5．感染 /鋪平板 6．篩選 粘粒載體：粘粒實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，帶有將 DNADNA 序列。大?。阂话?5kb 左右，可克隆 31～ 47kb 片段。 1 粘粒載體的用途： 1．在構(gòu)建基因文庫(kù)中，減少文庫(kù)中重組體的數(shù)目 2．在單個(gè)重組體中克隆和增殖完整的（較大的）真核基因或某一基因家族等 1 單鏈環(huán)狀 DNA 的絲狀大腸桿菌噬菌體： M1 f fd 噬菌體 1 單鏈?zhǔn)删w載體代表 M13： M13 噬菌體基 因組可編碼 3 類(lèi)蛋白質(zhì)：（ 1）復(fù)制蛋白 基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ；（ 2）形態(tài)發(fā)生蛋白 基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ；（ 3）結(jié)構(gòu)蛋白 基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ），所有結(jié)構(gòu)蛋白在形態(tài)發(fā)生之前都插入在宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中。 M13 不需要插入寄主的基因組， M13 通過(guò)細(xì)菌的纖毛進(jìn)入大腸桿菌，單鏈分子作為模板合成互補(bǔ)鏈，形成雙鏈 DNA 分子。 1 M13 噬菌體克隆載體：在 M13 噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個(gè)間隔區(qū)可用來(lái)插入外源 DNA（基因 Ⅱ /Ⅳ 和基因 Ⅷ /Ⅲ 之間）；基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的 508bp 間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點(diǎn)；在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之間的小間隔區(qū)也可用來(lái)插入外源片段；基因 Ⅹ 也可用來(lái)克隆外源片段。在 M13mp1 載體中，間隔區(qū)內(nèi)的 HaeⅢ 位點(diǎn)插入了 lacZ’選擇標(biāo)記基因 ，引入 α 互補(bǔ)篩選。第六個(gè)密碼子由天冬酰胺代替了天冬氨酸。 2 M13 噬菌體載體的宿主菌重要的遺傳標(biāo)志：（ 1） lacZ D Ml5 lacZ 基因 缺失突變體。（ 3） lacIq lacI 基因的突變體。（ 5） traD36 抑制 F39。（ 6） hsdRl7 與 hsdR 4 對(duì)大腸桿菌 K 株 Ⅰ 類(lèi)限制 修飾系統(tǒng)失去限制活性但仍保留修飾功能的突變體。（ 8） supE 琥珀抑制基因。特點(diǎn)：能像M13DNA 那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制，裝載量比常規(guī)的 M13mp 系列要大很多（ 10 kb），通過(guò)克隆雙鏈 DNA 能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈 DNA。含有將雙鏈分子轉(zhuǎn)化為單鏈分子的酶識(shí)別位點(diǎn)。可克隆 10kb 的 DNA 片段。；（ 2）基因組含 loxP 重組位點(diǎn)，由重組酶 Cre 催化。包裝過(guò)程 : ①始于一個(gè)長(zhǎng) 162bp的 P1 pac 位點(diǎn)，識(shí)別和切割此位點(diǎn)的是 P1 編碼的 pacase，切出的 pac 一端進(jìn)入預(yù)制頭部，當(dāng)其頭部充滿 DNA 后， DNA 再次被切。第二輪包裝則從非特異性切割出的末端開(kāi)始。 P1 頭部可容 110Kb。每個(gè)六聚體都有一個(gè)腺嘌呤甲基化位點(diǎn) (dam→ GATC), pacase 只作用甲基化的 pac 位點(diǎn)。 易于獲得大量特定的克隆 DNA。 克隆片段易于進(jìn)行次克隆 2 P1 噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的示意圖： pAd10 sacBⅡ — ScaI+BamHI — 長(zhǎng)臂 + 短臂 —加入外源 — DNA 片段 — 重組 DNA 分子 — 離體包裝 — 感染宿主細(xì)胞 2 宿主菌： NS3529 菌株基因型 recA， lacⅠ q， mcrABC， mrr； recA：防止插入 DNA片段內(nèi)的同源重組，以免發(fā)生重排； lacⅠ q ： 抑制 P1 裂解復(fù)制子 的激活 , 使 P1 質(zhì)粒復(fù)制子在細(xì)胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源 DNA 分子重排； mcr 和 mrr：抑制富含 GpMeC或 ApMeC 插入片段的選擇性丟失。 限制性核酸內(nèi)切酶概念：是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子中的某種特定核苷酸序列（ 4—8bp），并由此處切割 DNA 雙鏈的脫氧核酸內(nèi)切酶。細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（ R/M 體系））。（ 2）修飾：細(xì)菌自身的 DNA 堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別切割。 限制性?xún)?nèi)切酶的命名：按酶的來(lái)源的屬、種名而定， 取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作主語(yǔ)表示，如有株名，再加上一個(gè)字母；其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫(xiě)上羅馬數(shù)字。 I 型限制性?xún)?nèi)切酶：（ 1）識(shí)別位點(diǎn)序列：未甲基化修飾的特異序列。（ 3）作用機(jī)理：是三亞基雙功能酶，限制酶切與甲基化互斥，需 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。兩條鏈均甲基化：既不限制也不修飾；兩條鏈均未甲基化：限制即酶切；兩條鏈半甲基化：修飾未甲基化的鏈。二亞基雙功能酶 RMS 限制酶切與甲基化反應(yīng)同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)。（ 1）識(shí)別位點(diǎn)序列：未甲基化修飾的雙鏈 DNA 上的特殊靶序列（長(zhǎng)度，堿基的組成，多數(shù)是回文序列）與 DNA 的來(lái)源無(wú)關(guān)。 （ 2） 切割位點(diǎn)：酶切的結(jié)果：切開(kāi)雙鏈 DNA 形成粘性末端，平齊末端。① 5’端凸出，即靠近 5’端切割（如 EcoR I 切點(diǎn)），② 3’端凸出，即靠近 3’端切割（如 Pst I 切點(diǎn)）。（ 5）同裂酶和同位酶。（ 7）Ⅱ s 型限制性?xún)?nèi)切酶。（ 9）切口酶 1 粘性末端的意義：連接便利 ： i）不同的 DNA 雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。 ii）同一個(gè) DNA 分子內(nèi)連 接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。① 同裂酶：同序同切酶（識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同）；② 同位酶：同序異切（識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同）；③“同功多位” 許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的酶識(shí)別。 1 歸位內(nèi)切酶：是雙鏈 DNA 核酸酶，能識(shí)別較 長(zhǎng)的非回文序列（ 1240 bp），其編碼序列位于內(nèi)含子或內(nèi)含肽中。內(nèi)含子編碼的歸位內(nèi)切酶加前綴“ I”；內(nèi)含肽編碼的歸位內(nèi)切酶加前綴“ PI”。 1 三類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)比： I 型限制性?xún)?nèi)切酶（酶分子：三亞基雙功能酶；識(shí)別位點(diǎn)：二分非對(duì)稱(chēng)；切割位點(diǎn)：無(wú)特異性至少在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp；限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)：互斥；限制反應(yīng)需要 ATP）。 III 類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶（酶分子：二亞基雙功能酶；識(shí)別位點(diǎn)： 57bp 非對(duì)稱(chēng)；切割位點(diǎn)：在識(shí)別位點(diǎn)下游 2426bp；限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)：同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)；限制反應(yīng)需要 ATP）。 1 限制酶的酶活性：限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、 pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專(zhuān)一性。 星號(hào)（ *）活性：如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專(zhuān)一性和切割效率，稱(chēng)為星號(hào)（ *）活性。抑制星星活性的條件：① 減少酶的用量，避免過(guò)量酶切 ,減少甘油濃度 ② 保證反應(yīng)體系中無(wú)有機(jī)溶劑或乙醇 ③ 提高離子強(qiáng)度到 100～ 150mM (如果不