【正文】 得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。 實驗原理 DNA的連接策略質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。（13）沉淀洗滌，抽干后用ddH2O溶解，分裝并保存于20℃。（11）晾干后，用300ml無菌雙蒸水溶解染色體DNA，在37℃水浴中放置30分鐘。（9）取上清液，加一倍量異丙醇沉淀DNA，冰浴放置30分鐘，15 000rpm離心30分鐘。（離心前樣品管要進(jìn)行平衡，以免離心機受損）（7）在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液，混勻，室溫下12,000rpm離心30分鐘。（染色體DNA結(jié)合蛋白的消化）（5）取出后加入預(yù)冷的5M NaCl至最終濃度為1M，混勻后冰浴30分鐘（溶液要混合成為均相，并且冰浴要充分，時間可適當(dāng)延長）。（3）取出后加入10% SDS至最終濃度為1%，輕輕混勻，37℃保溫30分鐘澄清即可。 大腸桿菌中染色體DNA的抽提（1）大腸桿菌一級瓶培養(yǎng)過夜，以10%的接種量接二級瓶培養(yǎng)4～5小時后，培養(yǎng)物以50ml/管離心收獲（8 000 rpm，5min，4℃）。（3）迅速放置于常溫下15 000rpm離心10分鐘。 沸水浴制備染色體DNA（1）在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O，挑入米粒大小的菌團(tuán)，充分懸浮并混勻。質(zhì)粒雙鏈DNA量可以1 OD260nm＝50mg/ml計算。（13）用400ml 75%的冰乙醇洗滌一次，再15000rpm離心1min，傾去上清，倒扣離心管于濾紙上，稍許涼干，待用。（以電泳前端無RNA條帶為準(zhǔn)）（11）RNase消化完全后加入等體積的苯酚飽和溶液：氯仿混合溶液（1:1）（各300ml），充分混勻，4℃，15 000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。（9）加入100ml無菌重蒸水溶解質(zhì)粒DNA，可在37℃保溫5~10分鐘。（8）小心傾去上清液，注意避免把離心管底的白色DNA沉淀也隨同上清倒掉。注意不要將下層有機相混入上清液中。注意，不要把白色絮狀物混入上清液中。（4）打開離心管蓋，加入150ml溶液III，輕輕混勻（來回顛倒數(shù)次），看到淡黃色消失，有大量白色沉淀生成，然后離心。（4管/組)（2）在離心管中加入100ml溶液I懸浮菌體，渦旋振蕩，以充分懸浮菌體成均勻懸浮液。（6）沉淀涼干后用50ml無菌重蒸水溶解，樣品可取5ml酶切電泳分析或待用。（4）用牙簽挑去菌體碎片（白色沉淀），在上清液中加入100ml的異丙醇（注意不同樣品管中的溶液平衡），充分混勻后15 000rpm離心15分鐘。（2）上述菌體懸浮液沸水煮20秒。而對于大量的基因組DNA制備（如Southern Blotting，需大量基因組），可采用試劑盒抽提。常規(guī)實驗中從細(xì)菌基因組上PCR擴增目的基因時，一般所用的DNA量較少，可以采用較簡單的沸水浴裂解法制備少量的DNA。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強的抑制作用，因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時，應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。一般來說，構(gòu)建基因組文庫，初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的?；蚪MDNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。大腸桿菌菌株HB101及其衍生菌株（其中包括TG1）能產(chǎn)生大量的碳水化合物，不適用于煮沸法裂解。但對于那些經(jīng)變性劑，溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用該法。離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)，就可以從上清中回收質(zhì)粒DNA。但是閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈彼此不會分離，這是因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。 煮沸法質(zhì)粒DNA的抽提煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮在含有能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液III：由KAc與HAc組成。溶液II：由SDS與NaOH組成。該方法抽提質(zhì)粒主要的試劑為溶液I、II和III，其在抽提質(zhì)粒DNA中的作用如下：溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl組成。鹽等雜質(zhì)易在異丙醇中沉下。由于雜質(zhì)不易在乙醇中沉下，沉淀過程可在0℃進(jìn)行。抽提完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法將它們除去。酚/氯仿可節(jié)約重蒸酚。酚是一種作用非常強烈的蛋白質(zhì)變性劑，能非常有效地是蛋白質(zhì)變性進(jìn)而去除。純化步驟應(yīng)有針對性地將它們?nèi)コ?。達(dá)到分離的目的。當(dāng)溶液的pH值調(diào)節(jié)到大于12時，雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA雙鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅部分氫鍵被破壞，只是部分雙鏈解離成單鏈。本實驗采用堿性SDS法。（1）裂解細(xì)胞基本上先加入溶菌酶作用一段時間，破壁后再加入非離子型去污劑或直接加入堿性SDS等以及作煮沸處理，以便破壁與膜，處理的同時也能去除細(xì)胞碎片、染色體DNA等雜質(zhì)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。表31列舉了不同復(fù)制子類型的質(zhì)粒。一個理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測表型。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對抗生素的抗性，產(chǎn)生某些抗生素，降解復(fù)雜有機物，產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。當(dāng)細(xì)胞生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會丟失，因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性（Inpatibility）。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，質(zhì)?？截悢?shù)可由原來20多個擴增至10003000個，此時質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至4050%。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時，它也不能復(fù)制，通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒分子，如F因子。F質(zhì)粒（又稱F因子或性質(zhì)粒）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒（Plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。(7) 溴酚藍(lán)在凝膠中移出適當(dāng)距離后切斷電流，取出玻璃板，在紫外燈下觀查凝膠。(5) DNA樣品與10Loadingbuffer(含有溴酚藍(lán)和甘油等物質(zhì))混合后，用微量取樣器慢慢將混合物加至樣品槽中。(3) 用透明膠封固玻璃板兩頭，~，將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠模中，凝膠厚度在3~5mm之間。 圖21 常用的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量電泳圖 試劑與器材1. 試劑 （1）50TAE電泳緩沖液 Tris堿100ml （pH=） 冰醋酸 （2）EB母液（1mg/ml）稱取一定量的EB溶于無菌水中，室溫避光保存EB為強誘變劑，實驗中要防止污染 （3）DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量（自制）片段大小依次為：，單次電泳電樣量3～4ml即可，回收電泳加倍 （4）10Loading buffer（）EDTA 50mM甘油 60%Xylene Cyanol FF（W/V） %Bromophenol Blue（W/V） % （5）無菌雙蒸水 （6）瓊脂糖2. 器材 （1）eppendorf管 （2）槍頭 （3）移液器 （4）電泳槽 （5）電泳儀 （6）微波爐 （7）電泳板和梳子 （8）紫外投射分析儀 （9）數(shù)碼相機（帶紫外濾色鏡和近射鏡）(1) 用1TAE–Buffer按照被分離DNA分子的大小配制一定濃度(%)的瓊脂糖凝膠50ml，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。對于染色體DNA的酶切片段包含各種大小的條帶，上樣量即使超過10mg條帶也不會托尾，而單一條帶（10 kb）當(dāng)上樣量超過200ng就有可能產(chǎn)生托尾現(xiàn)象。 DNA電泳上樣量的控制在分析性電泳中，一般樣品投入量達(dá)50～100ng/帶即可觀察到清晰結(jié)果，而對于珍貴DNA樣品則上樣量達(dá)電泳的最低分辨率5～10ng/帶也可。（3） 指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。（2） 增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。一般常用的DNA電泳選用TAE較多，其電泳時間較快，而且成本比較低，但是其緩沖容量較低，需經(jīng)常更換電泳液。因此一般電泳可以忽略此因素，而對于特殊電泳，消除此因素影響可采用電泳后染色。當(dāng)DNA分子中嵌入的EB分子逐漸增多時，原來為負(fù)超螺旋狀態(tài)的分子開始向共價閉合環(huán)狀轉(zhuǎn)變，電泳遷移速度由快變慢；當(dāng)嵌入的EB分子進(jìn)一步增加時，DNA分子由共價閉合環(huán)狀向正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這時電泳遷移速率又由慢變快。實驗中要根據(jù)需要選擇合適電壓，如對于DNA大片段的分離可適當(dāng)選擇較低電壓進(jìn)行（在Southern雜交中的DNA電泳），避免托尾現(xiàn)象的產(chǎn)生；而對于小分子DNA，由于其在凝膠中的快速擴散會導(dǎo)致條帶模糊，可選用相對較高的電泳以縮短電泳時間。在精確測定DNA分子大小時，應(yīng)降低電壓至1V/cm。所以常規(guī)實驗中對于小片段DNA分子的分離采用高濃度的膠分離（有時甚至用2％的凝膠），而對于分離大片段則用低濃度的凝膠。（3） 不同的膠濃度 對于同種DNA分子膠濃度越高，電泳速率越慢。（2） DNA分子構(gòu)型 對于質(zhì)粒DNA分子即使具有相同分子質(zhì)量，因構(gòu)型不同也會造成電泳時受到的阻力不同，最終造成泳動速率的不同。電泳中影響DNA分子泳動的因素很多，主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。 DNA電泳影響因素DNA為堿性物質(zhì)，在電泳（緩沖液pH=8）時帶負(fù)電荷，在一定的電場力作用下向正極泳動。（5）其它類型。表21不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍瓊脂糖/％標(biāo)準(zhǔn)高強度低熔點低粘度低熔點700bp～25kb500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb80bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb100bp~3kb100bp~3kb500bp~1kb500bp~1kb100bp~500bp10bp～100bp由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸或過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝膠的再溶化，象NaClO4能用于凝膠的裂解，一般的凝膠回收試劑盒利用的也是這一原理。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。（2）瓊脂糖凝膠電泳 可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，～%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp～50kb。 實驗原理DNA電泳是基因工程中最基本的技術(shù)，DNA制備及濃度測定、目的DNA片段的分離，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。酶切失敗主要表現(xiàn)為兩方面：（1） 不完全酶切甚至是DNA基本未發(fā)生酶切；主要原因有：a）緩沖體系不合適，可進(jìn)行重新酶切；b）酶量加入過多而導(dǎo)致甘油抑制酶活，可將反應(yīng)體系適當(dāng)稀釋；c）DNA樣品雜質(zhì)含量高，可采用稀釋酶切或?qū)NA樣品重新抽提后酶切（2） DNA被降解（不成帶狀）；主要原因是DNA樣品中含有痕量的DNA酶，建議重新抽提除去DNA酶。加樣順序：水緩沖液DNA酶。特別是對不同廠商提供的酶進(jìn)行聯(lián)合酶切時，即可節(jié)約時間也可取得比較好的酶切效果。此方法通用性較強，聯(lián)合酶切也比較完全，但較耗時，而且DNA在沉淀時后有部分損失，要求開始時DNA的投入量要比較高。在DNA重組實驗中，經(jīng)常會用雙酶切（甚至是3個酶切鑒定）鑒定重組子或獲得不同粘性末端的DNA片段，而在廠商提供的聯(lián)合酶切緩沖液表中并不包括所有類型的酶，即使提供了“萬能緩沖液”，有些酶的聯(lián)合酶切也不一定能取得比較好的效果，這里介紹兩種通用的解決方法：（1） 分步酶切法 對將進(jìn)行的兩種酶的酶切采用分步的方法，即先選擇一個酶，采用此酶的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行酶切，酶切完全的DNA進(jìn)行沉淀后再溶解，然后選用第二個酶進(jìn)行最佳反應(yīng)。部分酶切實施方法：a）在不同的時間從同一個酶反應(yīng)管中取樣終止反應(yīng)，利用時間控制酶切程度，該方法比較繁瑣，不易掌握得恰到好處；b）固定酶切的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，控制酶的投入量，一般是在反應(yīng)管中加入不等量稀釋的酶，利用不同酶濃度控制酶切程度，該方法因易控制而被廣泛應(yīng)用。當(dāng)發(fā)生不明原因的酶切失敗時，常用的解決方法是采用稀釋酶切，即將酶切體系放大（如從15ml30ml），將雜質(zhì)相對濃度稀釋，這樣不需多增加酶量就能取得較好的酶切效果酶切方式可分為部分酶切與完全酶切：（1） 部分酶切 指的是同一DNA片段上的位點有些被切開而另