【正文】 分子生物學和生物信息學技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚酮生物合成調(diào)控的分子機理的闡明，人們 已經(jīng) 能 夠 有的放矢地利用抗生素基因簇資源，提高農(nóng)用抗生素產(chǎn)量與品種。 圖 166 螢光假單胞菌 合成蘇云金芽孢桿菌的 伴胞晶體 ， 用于開發(fā)生物囊殺蟲劑 (Gaertner et al., 1993) （ 2）基因工程抗病菌 放射農(nóng)桿菌 (Agrobacterium radiobacter) K84可產(chǎn)生 農(nóng)桿菌素 (agrocin) 84, 其組分為腺嘌呤脫氧阿拉伯糖苷氨基磷酸鹽，可有效地防治根癌農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)引起的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病。微生物肥料的使用可減少化肥用量、減少能源資源消耗。⑥腐熟劑，主要是加速高分子有機物分解為小分子養(yǎng)分物的腐生菌。提高根 瘤菌固氮能力的途徑主要有：①提高根瘤菌固氮相關(guān)的固氮酶、吸氫酶等基因的表達水平。當環(huán) 348 境中存在銨鹽時，根瘤菌的固氮能力就明顯降低，通過研究發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象是由于銨離子抑制了 nifA基因的表達造成的，由此構(gòu)建了不受銨阻遏的組成型表達的 nifA質(zhì)粒，將其引入根瘤菌中，得到了固氮作用不受銨阻遏的基因工程菌。在詳盡了解乳酸桿菌代謝機制的前提下，重新設(shè)計乳糖發(fā)酵與其它細菌生長所必需的代謝途徑之間的物流控制，最大限度地提高生產(chǎn)菌的生長速度，同時阻止乳酸合成途徑或強化表達殺菌素合成途徑，以增加乳制品的保鮮期。 ③ 將一種完整的氨基酸生物合成操縱子導入另一種氨基酸的生產(chǎn)菌中，建構(gòu)能同時合成兩種甚至多種氨基酸的工程菌。 由于大腸桿菌的代謝途徑以及遺傳操縱已較清晰，其操作的簡易使之成為代謝工 程的一種理想宿主，因此也可利用大腸桿菌來代替棒桿菌以及短桿菌進行氨基酸的合成。許多微生物可以通過不同途徑合成 2KLG。目前已有一百多種酶基因?qū)肓斯こ叹?，包括尿激酶基因和凝乳酶基因等?1990年美國 FDA已批準轉(zhuǎn)基因凝乳酶在干酪生產(chǎn)中使用。 （ 4） 其它酶制劑 采用基因工程手段生產(chǎn)工業(yè)用的酶種類很多 ， 如 超氧化物歧化酶 (SOD)，生產(chǎn)高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶等，都獲得了比原始菌高出數(shù)倍酶產(chǎn)率的基因工程菌株?？梢娡ㄟ^遺傳操作將不同的兩種代謝途徑和微生物組合在一起能意外地合成靛藍。 限制性內(nèi)切酶的商品化生產(chǎn)是將限制性內(nèi)切酶基因克隆到大腸桿菌內(nèi)，在人為條件下過量表達目的限制性內(nèi)切酶?？股卦诩毦膊≈委熤械膹V泛使用不僅使人類的健康水平有了巨大的提高，也挽救了無數(shù)的生命。但用 pIJ2303 轉(zhuǎn)化紫紅鏈霉菌 Tu22，將同時合成放線菌紫素和一種新的抗生素 二氫榴菌紫素 ?？茖W家借鑒好氧微生物用來抵御缺氧環(huán)境的策略，如好氧菌 透明顫菌屬 (Vitreoscilla)能 合成同源二聚體血紅素蛋白，將該基因克隆入鏈霉菌質(zhì)粒載體，在天藍色鏈霉菌中利用透明顫菌屬血紅蛋白基因的啟動子表達。近年來，隨著基因組和生物芯片技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展與滲透，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)在解決復雜的環(huán)境污染問題上顯示出獨特的能力。相比之下，微生物的生物富集不僅成本低，而且效率更高。 圖 1613 重組 富養(yǎng)羅爾斯通氏菌（ R. eutropha） MTβ對重金屬污染土壤的修復 （ Valls等， 2020） A，（ 1） 15天煙草苗生長在滅菌對照土壤中；（ 2）土壤中接種富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 (R. eutropha) CH34 108個 /g土；（ 3）土壤中接種重組富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 (R. eutropha) MTβ108個 /g土； B，土壤含鎘（ Cd2+） 150? ol/Kg土，（ 1）、（ 2）和（ 3）的處理同 A。芳烴及其衍生物降解基因通常連鎖成簇組成操縱子，如兒茶酚降解 基因 catABCD、氯代聯(lián)苯降解基因 bphABCD、 2,4D降解基因 tfdCDEF、氯代苯甲酸降解基因 xylABC和 xylDFEFG等。 （四）石油產(chǎn)品的微生物脫硫技術(shù) 汽油和柴油等石油產(chǎn)品的加工過程會使產(chǎn)品中硫含量提高，它們?nèi)紵a(chǎn)生的一氧化碳、氮氧化物（ NOx）、二氧化硫、碳氫化合物及可吸入顆粒物等嚴重污染了空氣。此外，還實現(xiàn)了甲基對硫磷水 解酶基因在芽孢桿菌中的高效表達，表達量提高了 20多倍，獲得既有農(nóng)藥降解能力又有生防功能的工程菌株。 （五）農(nóng)藥殘留的微生物降解技術(shù) 農(nóng)藥殘留微生物降解技術(shù)就是針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等化學農(nóng)藥的大量施用造成農(nóng)產(chǎn)品以及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中農(nóng)藥殘留嚴重超標、農(nóng)產(chǎn)品市場競爭力下 降等嚴重情況，克服物理、化學處理修復難度大、成本高，并且還會有二次污染的缺點，從生物技術(shù)的角度，利用微生物種類繁多、代謝類型極為豐富的特點，通過篩選高效農(nóng)藥殘留降解菌株，克隆降解基因并重組多種降解基因于某些宿主菌中，在可控條件下高效表達降解活性，利用微生物所產(chǎn)生的酶類應用于農(nóng)藥殘留的原位生物修復，達到徹底清除土壤、水體、農(nóng)產(chǎn)品中有機污染物的目的。采用生物漂白技術(shù)替代化學漂白法是今后造紙工業(yè)實現(xiàn)清潔生產(chǎn)的一個最重要發(fā)展方 向。通過基因工程的手段增強或增添菌株的污染物降解能力，能使其在工業(yè)、城市廢物或多種污染物混合環(huán)境中高效發(fā)揮生物解毒或降解功效。 Valls等（ 2020） 以 淋病奈瑟球菌 （ Neisseria gonorroheae） 中 IgA蛋白 βdomain編碼區(qū)與小鼠 MT基因編碼區(qū)融合，構(gòu) 建的重組蛋白通過轉(zhuǎn)座子載體 TnMTβ1導入 富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 CH34中，得到的基因工程菌MTβ能夠有效固定鎘離子，明顯降低了鎘離子對煙草生長的毒性（圖 1612，圖 1613）。如何降低和消除這些重金屬離子對環(huán)境造成的危害至今仍是一個挑戰(zhàn)。 四、 環(huán)境微生物基因工程菌的應用 環(huán)境微生物基因工程技術(shù)是實現(xiàn)有機廢物資源化的首選，它能將有機污染物轉(zhuǎn)化為沼氣、酒精、有機材料或原料、單細胞蛋白等。 （ 1）開發(fā)能有效利用氧氣的鏈霉菌 利用鏈霉菌進行大規(guī)?？股厣a(chǎn)時常常遇到的問題 355 是缺氧。該抗生素屬于 異苯并二 氫砒喃醌類 (isochromanequinones)抗生素家族。 354 對于其它限制性內(nèi)切酶以及其它分子克隆工具酶也可以用類似的方法超量表達從而大規(guī)模生產(chǎn)。 （四）限制性內(nèi)切酶的生產(chǎn) 限制性內(nèi)切酶天然存在于多種微生物中，是限制和修飾系統(tǒng)中的重要成分，是分子克隆和核酸分析研究的常用工具。假單胞菌是能夠利用萘、甲 苯、二甲苯、酚等復雜有機物作為唯一碳源、在環(huán)境保護領(lǐng)域有重要應用價值的微生物類群，它們通常具有約 50200kb 的降解質(zhì)粒 。但由于 β環(huán)狀糊精葡基轉(zhuǎn)移酶 (βcyclodextrin glucosyltransferase， βCGT)生產(chǎn)菌產(chǎn)酶活力低，導致 β環(huán)狀糊精因生產(chǎn)成本高，應用受 到限制。凝乳酶的另一生產(chǎn)途徑是直接從微生物中萃取，但它在使用中常常會引起奶酪的苦味，使其在實際應用中受到限制。目前酶制劑生產(chǎn)發(fā)展的主要方向是將生物技術(shù)應用于酶工程領(lǐng)域，生物酶工程主要包括三方面的內(nèi)容： ① 利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶； ② 對酶基因進行遺傳修飾； ③ 設(shè)計出新的酶基因。為提高成功率，在絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷和 L半胱氨酸非利用型的大腸桿菌中表達來自植物擬南芥中分離出不受反饋抑制影響的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，能產(chǎn)生更高水平的 L半胱氨酸。如果將三個關(guān)鍵的酶， 3脫氧 D阿拉伯糖 庚酮糖酸 7磷酸合成酶、鄰氨基苯甲酸合成酶和鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌，色氨酸的產(chǎn)量將會更高。導入的限速酶基因既可以是生產(chǎn)菌自身的內(nèi) 349 源基因，也可以是來自非生產(chǎn)菌 (如大腸桿菌 )的外源基因。要求工程菌對噬菌體具有抗性，乳糖代謝和蛋白酶合成基因能全程穩(wěn)定表達，從而提高乳糖的利用率，這在奶酪生產(chǎn)中極為重要； ② 改善發(fā)酵食品的品質(zhì)。 nifA基因的突變體不僅造成固氮酶活性的喪失，而且引起結(jié)瘤能力嚴重降低。其主要原因是在“老區(qū)”接種根瘤菌常面臨土著根瘤菌的競爭而降低了占瘤率和共生固氮效率。④植物根際促生菌或 植物根圈促生細菌 (PGPR)， 又叫 ―增產(chǎn)菌 ‖或 ―多效菌劑 ‖，這是一類能在植物根部大量定殖的有益菌群，它們可抑制植物病原菌生長。 （ 二 ） 微生物肥料 利用微生物的生命活動及代謝產(chǎn)物的作用，改善作物養(yǎng)分供應，為農(nóng)作物提供營養(yǎng)元素、生長物質(zhì)、調(diào)控生長、增強抗逆性，達到提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、減少化肥使用、提高土壤肥力 的 一類生物制品就是微生物肥料。以下簡要舉例。 阿維菌素是目前世界上有關(guān)生物合成基因簇研究 得 最為深入的抗生素之一， 產(chǎn)生阿維菌素的 阿維鏈霉菌（ Streptomyces avermitilis） 的全基因組測序已經(jīng)完成， 在利用基因工程進行抗生素的人工改造方面已有了許多成功的范例。 蘇云金芽孢桿菌 表達系統(tǒng) 的構(gòu)建 涉及 以下 方面 ： 首先確定 載體的類型 , 主要是質(zhì)粒載體，同時為了復 制的穩(wěn)定，一般用 Bt自身質(zhì)粒的復制區(qū)作為載體的復制單元 ，如前面所述的穿梭載體 pHT304。為了提高目標基因的表達量，可利用幫助蛋白基因使表達的晶體蛋白更易形成伴胞晶體而提高表達量 ，或通過更換 cry3Aa 殺蟲晶體蛋白基因 的啟動子來克服 ?因子的競爭而提高表達量。 重組微生物殺蟲劑 —— 蘇云金芽孢桿菌基因工程及應用 蘇云金芽孢桿菌 是目前國內(nèi)外產(chǎn)量最大、應用范圍最廣的微生物殺蟲劑。 在接下來的內(nèi)容里，將簡單介紹一些重要的基因工程細菌。但是隨著細胞表面展示技術(shù)、分子生物學技術(shù)以及相關(guān)的生物技術(shù)的發(fā)展，微生物細胞表面展示技術(shù)的工業(yè)化應用為時不遠。 微生物細胞表 面表達系統(tǒng) 微生物細胞表面展示系統(tǒng)的構(gòu)成包括載體蛋白、目的蛋白和宿主菌株三部分。 圖 162 pDG148Stu表達載體的結(jié)構(gòu) ble：博萊霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； kan：卡那霉素抗性基因； Pspac：雜合啟動子； lacI：乳糖操縱子阻遏蛋白基因。 芽孢桿菌表達系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)是一種革蘭氏陽性、無莢膜、能運動的桿狀細菌 ，無致病性，對人畜無毒，是 革蘭氏陽性細菌的主要代表 。在下面的章節(jié)里，主要介紹幾種比較常見的其他細菌基因工程表達系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和特點。 一些以可溶性蛋白形式表達時易被降解的蛋白質(zhì)，以包涵體形式表達時卻可以很穩(wěn)定。用于融合的表達標簽 (tag)蛋白和多肽有 六聚組氨酸肽 (6xHis)和 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 (GST)。將 棒桿菌 (Corynebacterium sp.)的2,5DKG還原酶基因轉(zhuǎn)入歐文氏菌，能成功地將 D葡萄糖轉(zhuǎn)化成 2KLG。例如，用于蘇云金芽孢桿菌的克隆載體 pHT304的基礎(chǔ)骨架為大腸桿菌克隆載體 pUC18, 另裝有能 在 Bt 中復制的質(zhì)粒復制區(qū)序列ori1030和用于選擇的紅霉素抗性基因。 關(guān)于大腸桿菌表達系統(tǒng)，在本書的前面章節(jié)已有詳細介紹，在此不作贅述。為此，要嚴格按照轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例的要求，認真開展重組細菌的生物安全性評價研究。在美國，轉(zhuǎn) Bt遺傳工程菌用以防治蔬菜害蟲和玉米害蟲的面積分別占總面積的 80%和 50%，銷售額從 80年 代末的 4000萬美元上升到 90年代的 5億多美元。但是，由于自然菌株和傳統(tǒng)技術(shù)本身的一些缺陷與不足，諸如研究周期長、成本高、活性低等，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)微生物的產(chǎn)業(yè)化受到很大限制。 芬蘭的一家酒精生產(chǎn)公司首先用基因工程芽孢桿菌生產(chǎn) ?淀粉酶 (?amylase)，取得了可觀的經(jīng)濟效益。 美國科學家已用基因工程將攜帶不同降解能力的質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移導入同一個細菌中，從而培育出了一種能同時降解四種烴類的 “超級工程菌” (superbug)。 ④ 生產(chǎn)天然稀有的醫(yī)用活性多肽或蛋白質(zhì)，例如用于抗病毒、抗腫瘤的藥物干擾素和白細胞介素；用于治療心血管系統(tǒng)疾病的尿激酶原和組織型溶纖蛋白酶原激活因子；用于防治傳染病的多種疫苗 (如乙型 肝炎疫苗和腹瀉疫苗 )；用于體內(nèi)起調(diào)節(jié)作用的胰島素和其它生長激素等等。 1973年，波依爾 (Boyer)和科恩 (Cohen)首次完成外源基因在大腸桿菌中的表達，在實驗室里實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移，為基因 工程開啟了通向現(xiàn)實應用的大門，使人們有可能按照自己的意愿利用重組 DNA技術(shù)改造和設(shè)計新的生命體。 在細菌基因工程誕生之前，人們主要通過誘變來提高產(chǎn)量或者通過控制代謝途徑而在有限程度上改變產(chǎn)品的性質(zhì)。 335 細菌工程菌與環(huán)境保護 當人類越來越深刻地意識到保護環(huán)境的重要性時，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)作 為環(huán)境保護的最有力和最有效的技術(shù)手段，應運而生，引起各國政府、科技界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛重視，得到了前所未有的關(guān)注和發(fā)展。 細菌工程菌與食品、飼料及其他工業(yè) 在發(fā)酵工業(yè)上，利用生物技術(shù)構(gòu)建的品質(zhì)優(yōu)良的食用乳酸桿菌提高了生產(chǎn)菌在食品發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性，改善了發(fā)酵食品的質(zhì)量并且降低了成本，大大縮短生產(chǎn)周期，具有巨大的經(jīng)濟價值和社會效益。 336 在過去的二十年里，重組細菌參與 的全新的或者說是更高效的生產(chǎn)過程已經(jīng)投入工業(yè)應用，純度更高、成本更低廉的以及用傳統(tǒng)化學方法不能得到的物質(zhì)被大量生產(chǎn)出來。美國環(huán)境保護局 (EPA)和美國農(nóng)業(yè)部 (USDA)批準環(huán)境釋放的微生物遺傳工程菌涉及十幾種微生物約 50例左右，基因組中整合了外源 dctABD基因、能提高苜蓿共生固氮能力和大田產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因重組苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)是目前世界上首例通過了遺傳工程菌