基因工程ppt課件(存儲(chǔ)版)
【正文】 DNA的DNA聚合酶 11 Trizol試劑 Trizol的主要成分是 苯酚 。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過(guò) 異丙醇沉淀 來(lái)還原。 ssDNA: 1A260 ≈ 37ug/ml 。 電泳緩沖液還有一個(gè)組分是 EDTA， 加入濃度為 12mmol/L，目的是螯合 Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止 Mg2+離子與核酸生成沉淀。 34 35 ? 基因組 DNA文庫(kù)， Genomic libraries : 含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組 DNA克隆群體； ? cDNA文庫(kù)， cDNA libraries： 是指含有所有重組 cDNA的克隆群體。 ? 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序。這種重組子的篩選，又稱為 藍(lán)白斑篩選 。在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，其表達(dá)方式不盡相同。 53 由 α互補(bǔ)而產(chǎn)生的 LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG的作用下，在生色底物 XGal存在時(shí)產(chǎn)生 藍(lán)色菌落 ，因而易于識(shí)別。 47 5. 重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)化 是指將質(zhì)?；蚱渌庠?DNA導(dǎo)入處于 感受態(tài)的 宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過(guò)程。 ? 這種 熱變性 復(fù)性 延伸 的過(guò)程 就是一個(gè) PCR循環(huán)， PCR就 是這種循環(huán)的不斷重復(fù)。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，使溶液兩極的 pH保持基本不變。 18 cDNA第二鏈的合成方法－ 置換合成法 DNApol dNTPs RNaesH 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4DNA ligase 該方法使用較多 19 3. 質(zhì)粒 DNA的分離與純化 ? 質(zhì)粒（ plasmid） : 指細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外能自主復(fù)制的遺傳單位 ? 共價(jià)閉合環(huán)狀 ? 質(zhì)粒 DNA的分離：細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒 DNA擴(kuò)增；細(xì)菌菌體的裂解；質(zhì)粒 DNA的分離 20 質(zhì)粒 DNA的提取 —— 堿裂解法的原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)用 堿處理 DNA溶液時(shí)，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性， 共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在回到中性 pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的 超螺旋質(zhì)粒 DNA分子 則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。 13 Trizol法提取總 RNA的實(shí)驗(yàn)原理： Trizol試劑裂解細(xì)胞并釋放出 RNA,酸性條件使RNA與 DNA分離 ,加入氯仿后離心，樣品分成 水樣層和有機(jī)層 。 ? 總的原則 : 保證一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 。1 第七章 基因工程 (gene engineering) 2 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 產(chǎn) 品 功 能 組織胞漿素原激活劑 抗凝 血液因子 VIII 促進(jìn)
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