【文章內容簡介】 酶量增加使反應特異性下降 。酶量過少影響反應產量。 4） dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種 dNTP濃度應相等 濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量 dNTP可與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑， mmol/ mmol/L反應體系； Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產量下降； Mg2+過高影響反應特異性； Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中 dNTP、 EDTA等的濃度影響反應中游離的 Mg2+濃度。 （ 6） 緩沖液（ Buffer） 10 mmol/L TrisHCl 調節(jié) pH，使 Taq酶活性作用環(huán)境維持在扁堿性（ pH ,室溫） 50 mmol/L KCL 有利于引物的退火，但過高會抑制 Taq酶活性 % BSA， 保護酶不變性失活。 1） 變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 95 oC， 2030 秒 2） 退火 溫度由引物長度和 GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合 。 降低溫度可增加反應的靈敏性。 2）循環(huán)參數 3） 延伸 7075 oC， 延伸時間由擴增片段長度決定。 4） 循環(huán)次數 主要取決于模版 DNA的濃度； 一般為 2535 次； 次數過多：擴增效率降低， 錯誤摻入率增加。 PCR反應曲線 抑制 PCR 反應的物質 DNA 聚合酶 來 源 PCR產物 末端 3’? 5’ 外切酶 活性 (校正 ) Taq DNA 聚合酶 Thermus aquaticus 3’A 無 Pfx DNA聚合酶 Thermococcus sp. KOD 平端 有 Pfu DNA 聚合酶 Pyrococcu furiosus 平端 有 Pwo DNA 聚合酶 Pyrococcu woesei 平端 有 Vent DNA 聚合酶 Thermococcus litoralis 平端 有 Deep Vent DNA 聚合酶 Pyrococcu sp. GBD 平端 有 UITma DNA 聚合酶 Thermotoga maritima 平端 有 Tth DNA 聚合酶 Thermus thermophilus 3’A 無 常用的 熱 穩(wěn)定 DNA 聚合酶 （三） PCR的特點 1. 特異性強 2. 靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。 3. 簡便、快速 PCR反應一般在 2～ 4 小時完成擴增反應。 對標本的純度要求低。 擴增產物一般用電泳分析，無放射性污染、易推廣。 待擴增片段： 1000 bp 引物 Tm ＝ 55℃ DNA 模板變性 : 94℃ , 5分鐘 。 PCR 循環(huán) (30 次 ): 94℃ , 30秒 。 50℃ , 30秒 。 72℃ , 1分鐘 。 最終延伸 : 72℃ , 710分鐘 PCR 反應條件的設定 PCR 產物的檢測 瓊脂糖凝膠電泳 PCR 產物 PCR 產物 三、 PCR常見問題 無擴增產物（假陰性） 非特異性擴增 拖尾 假陽性 無擴增產物 1. 模板 :含有抑制物，含量低； 2. Buffer對樣品不合適； 3. 引物設計不當或者發(fā)生降解； 4. 反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短。 原因 對 策 1. 純化模板或者加大模板的用量； 2. 更換 Buffer或調整濃度； 3. 重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物； 4. 降低退火溫度、延長延伸時間。 ?現象： 正對照有條帶 ， 而樣品則無 。 非特異性擴增 ? 現象： PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致 ， 或大或小 ， 或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶 。 1. 引物特異性差 2. 模板或引物濃度過高 3. 酶量過多 4. Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. 循環(huán)次數過多 原因 對 策 1. 重新設計引物或者使用巢式 PCR 2. 適當降低模板或引物濃度 3. 適當減少酶量 4. 降低鎂離子濃度 5. 適當提高退火溫度或使用二階段溫度法 6. 減少循環(huán)次數 非特異性擴增 拖尾 ? 現象： 產物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) 。 M 1 2 1. 模板不純 2. Buffer不合適 3. 退火溫度偏低 4. 酶量過多 5. dNTP、 Mg2+濃度偏高 6. 循環(huán)次數過多 原因 對 策 1. 純化模板 2. 更換 Buffer 3. 適當提高退火溫度 4. 適量用酶 5. 適當降低 dNTP和 鎂離子的濃度 6. 減少循環(huán)次數 拖 尾 假陽性 ? 原因： 靶序列或擴增產物的交叉污染 ? 現象： 空白對照出現目的擴增產物 。 ? 對策： 1） 操作時應小心輕柔 ， 防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外； 2） 除酶及不能耐高溫的物質外 ， 所有試劑或器材均應高壓消毒 。 所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用 。 3） 各種試劑最好先進行分裝 ， 然后低溫貯存 。 （一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及 EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 （二）設立對照 陽性對照： 陽性模板 陰性對照： 陰性模板 試劑對照： 除模板外的所有組分 其他注意的事項 四、 PCR的類型及應用 重組 PCR 不對稱 PCR 反向 PCR 多重 PCR 原位 PCR RT－ PCR 巢式 PCR 遞減 PCR 熱啟動 PCR 實時定量 PCR 一、 PCR的類型 巢式 PCR 用第 2 對引物來驗證用第 1 對引物所擴增的 PCR 產物 PCR 環(huán)化 反向 PCR 熱啟動 PCR （ HotStart PCR） ? 熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲 DNA合成 ，直到 PCR 儀達到變性溫度； ? 現在有很多公司都有 HotStart Taq酶出售 ， 該酶具有熱啟動的性能 ， 使用簡單方便 ， 適合于高通量應用； ? 熱啟動 PCR是除了好的引物設計之外 ， 提高 PCR特異性最重要的方法之一 。 逆 (反 ) 轉錄酶 以 mRNA 為模板合成 第 1 條 cDNA 鏈，然后通過 PCR 反應 擴增出許多 cDNA 分子拷貝。 RTPCR 是 擴增 mRNA 的快速 及 靈敏的方法。 1. 檢測某一基因在轉錄水平的表達 2. 克隆特異的 cDNA RTPCR 5’ 3’ AAAAA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ RTPCR 原理 mRNA 1st cDNA 逆轉錄酶、 下游引物、 dNTPs DNA 聚合酶、 上游及下游引物、 dNTPs 5’ 5’ 3’ 3’ 特異 PCR 產物 5’ 5’ 3’ 3’ 經 30 個循環(huán)，產生 230 個分子拷貝 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 一步法 RTPCR RT 反應與 PCR 反應在同一個試管中進行。 兩步法 RTPCR RT 反應與 PCR 反應在不同的試管中進行。 下游引物 ? 特異性引物 ? Oligo(dT) ? ?actin ? GAPDH (glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase) ? 18S rRNA 用 作 內參 的管家基因 Real Time Quantitative PCR, qRTPCR 在 PCR 反應體系中加入熒光報告基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測 PCR 反應 進程，對擴增的 PCR 產物 進行定量分析的方法。 ? 具有高度敏感性：用于檢測微量的 DNA 或 RNA 樣品 ； ? 檢測每一次 PCR 循環(huán)中產物的積累； ? 擴增反應結束后不需要對 PCR 產物進行電泳。 R = Reporter (熒光報告染料 ) Q = Quencher (淬滅物 ) TaqMan 探針 當 TaqMan 探針完整時，熒光報告染料發(fā)射的熒光被淬滅物所淬滅。 在延伸反應中， 熒光報告染料被 DNA 聚合酶切除后與淬滅物分離，其熒光 信號被檢測。 QuantiProbe 不與 DNA 分子結合時，熒光報告染料發(fā)射的熒光被淬滅物所淬滅。 當引物退火時， QuantiProbe 與單鏈 DNA 分子雜交，熒光報告染料與淬滅物分離，其信號被檢測。 在延伸反應時， QuantiProbe 被置換，熒光報告染料發(fā)射的熒光又被淬滅物淬滅。 QuantiProbe 不規(guī)則結構的探針 Molecular Beacons 發(fā)夾結構的探針 ① 研究：基因克隆， DNA測序，分析突變 ② 診斷：細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 ③ 人類基因組工程：遺傳圖譜的構建， DNA測序，表達圖譜 ④ 法醫(yī)：犯罪現場標本分析 ⑤ 腫瘤：各種腫瘤檢測 ⑥ 其他 …… 二、 PCR的應用 用于 克隆 PCR 產物的載體 lacZ PCR 產物 dA 平端克隆載體 : 用于克隆平端 PCR 產物 dA dT dT lacZ 載體 lacZ PCR 產物 lacZ 載體 TA 克隆 載體 : 用于克隆 3’ 端攜帶 A 的 PCR 產物 PCR 定向突變 基因 1M 和 2M 引物含有突變的堿基 使用 Touch down PCR 便于 A 和 B 的退火 梯度 (Gradient) PCR 儀 降落 PCR (Touch down PCR) 每隔一個循環(huán)降低 1℃ 反應退火溫度，直至達到 “ Touch down” 退火溫度。 正常人血紅蛋白 ? 亞基 鐮刀型貧血病人血紅蛋白 ? 亞基 鐮刀型貧血病人血紅蛋白 ? 亞基編碼基因 正常人血紅蛋白 ? 亞基編碼基因 PCR DdeI 酶切 瓊脂糖凝膠電泳 變性 PCR 產物的 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1. 一條染色體上的 DNA 發(fā)生突變 2. 正常對照 PCRSSCP 第二章、基因工程的基本技術 第一節(jié) 核酸的提取與質量測定 第二節(jié) PCR技術 第三節(jié) 核酸的凝膠電泳 第四節(jié) 核酸雜交技術 核酸按戊糖分為兩大類： ? 脫氧 核糖核酸（ DNA） Deoxyribonucleic Acid ? 核糖核酸（ RNA） Ribonucleic Acid * rRNA （ ribosomal RNA ） 80% * tRNA （ transfer RNA ） 15% * mRNA （ mesenger RNA） 5% 核酸的種類 ?核酸 是由 核苷酸 或 脫氧核苷酸 通過 3’， 5’ 磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。 ? DNA主要 儲存 遺傳信息。 ? RNA主要 傳遞 遺傳信息。 真核細胞 原核細胞 DNA ?細胞核（ 95%） ： 線型雙鏈，一般與組蛋白結合成染色體 ?線粒體、葉綠體（ 5%）：環(huán)狀雙鏈 線型雙鏈 ?主要集中于 核區(qū) ?質粒 DNA：染色體外 DNA RNA ?細胞質（ 75%） ?線粒體、葉綠體（ 15%） ?細胞核（ 10%） 主要在 細胞質 核酸的分布 核酸的理化性質 ? RNA的純品