【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 酶量增加使反應(yīng)特異性下降 。酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 4） dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種 dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑， mmol/ mmol/L反應(yīng)體系； Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性； Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中 dNTP、 EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 （ 6） 緩沖液（ Buffer） 10 mmol/L TrisHCl 調(diào)節(jié) pH，使 Taq酶活性作用環(huán)境維持在扁堿性（ pH ,室溫） 50 mmol/L KCL 有利于引物的退火，但過(guò)高會(huì)抑制 Taq酶活性 % BSA， 保護(hù)酶不變性失活。 1） 變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 95 oC， 2030 秒 2） 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和 GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。 降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 2）循環(huán)參數(shù) 3） 延伸 7075 oC， 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。 4） 循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度； 一般為 2535 次； 次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低， 錯(cuò)誤摻入率增加。 PCR反應(yīng)曲線 抑制 PCR 反應(yīng)的物質(zhì) DNA 聚合酶 來(lái) 源 PCR產(chǎn)物 末端 3’? 5’ 外切酶 活性 (校正 ) Taq DNA 聚合酶 Thermus aquaticus 3’A 無(wú) Pfx DNA聚合酶 Thermococcus sp. KOD 平端 有 Pfu DNA 聚合酶 Pyrococcu furiosus 平端 有 Pwo DNA 聚合酶 Pyrococcu woesei 平端 有 Vent DNA 聚合酶 Thermococcus litoralis 平端 有 Deep Vent DNA 聚合酶 Pyrococcu sp. GBD 平端 有 UITma DNA 聚合酶 Thermotoga maritima 平端 有 Tth DNA 聚合酶 Thermus thermophilus 3’A 無(wú) 常用的 熱 穩(wěn)定 DNA 聚合酶 （三） PCR的特點(diǎn) 1. 特異性強(qiáng) 2. 靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克水平。 3. 簡(jiǎn)便、快速 PCR反應(yīng)一般在 2～ 4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。 對(duì)標(biāo)本的純度要求低。 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，無(wú)放射性污染、易推廣。 待擴(kuò)增片段： 1000 bp 引物 Tm ＝ 55℃ DNA 模板變性 : 94℃ , 5分鐘 。 PCR 循環(huán) (30 次 ): 94℃ , 30秒 。 50℃ , 30秒 。 72℃ , 1分鐘 。 最終延伸 : 72℃ , 710分鐘 PCR 反應(yīng)條件的設(shè)定 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳 PCR 產(chǎn)物 PCR 產(chǎn)物 三、 PCR常見(jiàn)問(wèn)題 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物（假陰性） 非特異性擴(kuò)增 拖尾 假陽(yáng)性 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 1. 模板 :含有抑制物，含量低； 2. Buffer對(duì)樣品不合適； 3. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解； 4. 反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短。 原因 對(duì) 策 1. 純化模板或者加大模板的用量； 2. 更換 Buffer或調(diào)整濃度； 3. 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物； 4. 降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。 ?現(xiàn)象： 正對(duì)照有條帶 ， 而樣品則無(wú) 。 非特異性擴(kuò)增 ? 現(xiàn)象： PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致 ， 或大或小 ， 或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶 。 1. 引物特異性差 2. 模板或引物濃度過(guò)高 3. 酶量過(guò)多 4. Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. 循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原因 對(duì) 策 1. 重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式 PCR 2. 適當(dāng)降低模板或引物濃度 3. 適當(dāng)減少酶量 4. 降低鎂離子濃度 5. 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 6. 減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴(kuò)增 拖尾 ? 現(xiàn)象： 產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) 。 M 1 2 1. 模板不純 2. Buffer不合適 3. 退火溫度偏低 4. 酶量過(guò)多 5. dNTP、 Mg2+濃度偏高 6. 循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原因 對(duì) 策 1. 純化模板 2. 更換 Buffer 3. 適當(dāng)提高退火溫度 4. 適量用酶 5. 適當(dāng)降低 dNTP和 鎂離子的濃度 6. 減少循環(huán)次數(shù) 拖 尾 假陽(yáng)性 ? 原因： 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 ? 現(xiàn)象： 空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 。 ? 對(duì)策： 1） 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔 ， 防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； 2） 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外 ， 所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒 。 所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用 。 3） 各種試劑最好先進(jìn)行分裝 ， 然后低溫貯存 。 （一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及 EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無(wú)菌操作 （二）設(shè)立對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照： 陽(yáng)性模板 陰性對(duì)照： 陰性模板 試劑對(duì)照： 除模板外的所有組分 其他注意的事項(xiàng) 四、 PCR的類型及應(yīng)用 重組 PCR 不對(duì)稱 PCR 反向 PCR 多重 PCR 原位 PCR RT－ PCR 巢式 PCR 遞減 PCR 熱啟動(dòng) PCR 實(shí)時(shí)定量 PCR 一、 PCR的類型 巢式 PCR 用第 2 對(duì)引物來(lái)驗(yàn)證用第 1 對(duì)引物所擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物 PCR 環(huán)化 反向 PCR 熱啟動(dòng) PCR （ HotStart PCR） ? 熱啟動(dòng)主要是通過(guò)抑制一種基本成分延遲 DNA合成 ，直到 PCR 儀達(dá)到變性溫度； ? 現(xiàn)在有很多公司都有 HotStart Taq酶出售 ， 該酶具有熱啟動(dòng)的性能 ， 使用簡(jiǎn)單方便 ， 適合于高通量應(yīng)用； ? 熱啟動(dòng) PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外 ， 提高 PCR特異性最重要的方法之一 。 逆 (反 ) 轉(zhuǎn)錄酶 以 mRNA 為模板合成 第 1 條 cDNA 鏈，然后通過(guò) PCR 反應(yīng) 擴(kuò)增出許多 cDNA 分子拷貝。 RTPCR 是 擴(kuò)增 mRNA 的快速 及 靈敏的方法。 1. 檢測(cè)某一基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá) 2. 克隆特異的 cDNA RTPCR 5’ 3’ AAAAA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ RTPCR 原理 mRNA 1st cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶、 下游引物、 dNTPs DNA 聚合酶、 上游及下游引物、 dNTPs 5’ 5’ 3’ 3’ 特異 PCR 產(chǎn)物 5’ 5’ 3’ 3’ 經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生 230 個(gè)分子拷貝 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 一步法 RTPCR RT 反應(yīng)與 PCR 反應(yīng)在同一個(gè)試管中進(jìn)行。 兩步法 RTPCR RT 反應(yīng)與 PCR 反應(yīng)在不同的試管中進(jìn)行。 下游引物 ? 特異性引物 ? Oligo(dT) ? ?actin ? GAPDH (glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase) ? 18S rRNA 用 作 內(nèi)參 的管家基因 Real Time Quantitative PCR, qRTPCR 在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光報(bào)告基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 反應(yīng) 進(jìn)程，對(duì)擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物 進(jìn)行定量分析的方法。 ? 具有高度敏感性：用于檢測(cè)微量的 DNA 或 RNA 樣品 ； ? 檢測(cè)每一次 PCR 循環(huán)中產(chǎn)物的積累； ? 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不需要對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳。 R = Reporter (熒光報(bào)告染料 ) Q = Quencher (淬滅物 ) TaqMan 探針 當(dāng) TaqMan 探針完整時(shí)，熒光報(bào)告染料發(fā)射的熒光被淬滅物所淬滅。 在延伸反應(yīng)中， 熒光報(bào)告染料被 DNA 聚合酶切除后與淬滅物分離，其熒光 信號(hào)被檢測(cè)。 QuantiProbe 不與 DNA 分子結(jié)合時(shí)，熒光報(bào)告染料發(fā)射的熒光被淬滅物所淬滅。 當(dāng)引物退火時(shí)， QuantiProbe 與單鏈 DNA 分子雜交，熒光報(bào)告染料與淬滅物分離，其信號(hào)被檢測(cè)。 在延伸反應(yīng)時(shí)， QuantiProbe 被置換，熒光報(bào)告染料發(fā)射的熒光又被淬滅物淬滅。 QuantiProbe 不規(guī)則結(jié)構(gòu)的探針 Molecular Beacons 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針 ① 研究：基因克隆， DNA測(cè)序，分析突變 ② 診斷：細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷 ③ 人類基因組工程：遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜 ④ 法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析 ⑤ 腫瘤：各種腫瘤檢測(cè) ⑥ 其他 …… 二、 PCR的應(yīng)用 用于 克隆 PCR 產(chǎn)物的載體 lacZ PCR 產(chǎn)物 dA 平端克隆載體 : 用于克隆平端 PCR 產(chǎn)物 dA dT dT lacZ 載體 lacZ PCR 產(chǎn)物 lacZ 載體 TA 克隆 載體 : 用于克隆 3’ 端攜帶 A 的 PCR 產(chǎn)物 PCR 定向突變 基因 1M 和 2M 引物含有突變的堿基 使用 Touch down PCR 便于 A 和 B 的退火 梯度 (Gradient) PCR 儀 降落 PCR (Touch down PCR) 每隔一個(gè)循環(huán)降低 1℃ 反應(yīng)退火溫度，直至達(dá)到 “ Touch down” 退火溫度。 正常人血紅蛋白 ? 亞基 鐮刀型貧血病人血紅蛋白 ? 亞基 鐮刀型貧血病人血紅蛋白 ? 亞基編碼基因 正常人血紅蛋白 ? 亞基編碼基因 PCR DdeI 酶切 瓊脂糖凝膠電泳 變性 PCR 產(chǎn)物的 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1. 一條染色體上的 DNA 發(fā)生突變 2. 正常對(duì)照 PCRSSCP 第二章、基因工程的基本技術(shù) 第一節(jié) 核酸的提取與質(zhì)量測(cè)定 第二節(jié) PCR技術(shù) 第三節(jié) 核酸的凝膠電泳 第四節(jié) 核酸雜交技術(shù) 核酸按戊糖分為兩大類： ? 脫氧 核糖核酸（ DNA） Deoxyribonucleic Acid ? 核糖核酸（ RNA） Ribonucleic Acid * rRNA （ ribosomal RNA ） 80% * tRNA （ transfer RNA ） 15% * mRNA （ mesenger RNA） 5% 核酸的種類 ?核酸 是由 核苷酸 或 脫氧核苷酸 通過(guò) 3’， 5’ 磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。 ? DNA主要 儲(chǔ)存 遺傳信息。 ? RNA主要 傳遞 遺傳信息。 真核細(xì)胞 原核細(xì)胞 DNA ?細(xì)胞核（ 95%） ： 線型雙鏈，一般與組蛋白結(jié)合成染色體 ?線粒體、葉綠體（ 5%）：環(huán)狀雙鏈 線型雙鏈 ?主要集中于 核區(qū) ?質(zhì)粒 DNA：染色體外 DNA RNA ?細(xì)胞質(zhì)（ 75%） ?線粒體、葉綠體（ 15%） ?細(xì)胞核（ 10%） 主要在 細(xì)胞質(zhì) 核酸的分布 核酸的理化性質(zhì) ? RNA的純品