基因工程研究策略和實踐(編輯修改稿)
2024-10-08 20:49 本頁面
【文章內容簡介】 charon10。 4. Cosmid質粒 由 λ DNA cos區(qū)與質粒重組建造而成。在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復制，但不表達噬菌體的任何功能。 分子量?。s 4— 6kb），可容納大至 4050kb的外源 DNA片段。適用于構建真核細胞的基因文庫。 如 cosmid pHC79 三、體外 DNA重組 ? 概念： 不同來源的 DNA片段 共價連接 、通過重新組合構成了具有兩個 DNA分子遺傳信息的新 重組體 DNA分子的過程。 ? 分類： ?粘末端連接 ?平齊末端連接法 ?同聚物核苷酸末端法 ?人工接頭連接 ?TA克隆 限制性內切酶 ― “分子剪刀” ? Ⅱ 型限制性內切酶 ，能專一地識別 DNA分子上特定的堿基序列并將 DNA切斷的內切酶。 識別序列的特點 ； (I)專一； (2)常由 4–6個堿基組成； (3)具有回文序列 ? 經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端。 ? 可以產(chǎn)生相同粘性末端的不同的限制酶稱作同尾酶。 DNA連接酶 ― “ 分子針線” ? 連接雙鏈 DNA分子中相鄰 3’ OH和5’ 磷酸基之間的磷酸二酯鍵的形成。 ? 最常用的是 T4連接酶，可以連接粘性末端和平頭末端。 1. 粘末端連接 （ a） 目的基因和載體用 同一種限制酶切割 后連接。載體易 自身環(huán)化 。 用 堿性磷酸酶 (能除掉 DNA5’ 端 P基團 ， 使 5’端帶一 OH)處理載體 ， 可防止載體自身環(huán)化 。 （ b） 目的基因和載體用 兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶切割 后連接 ， 可控制目的基因的插入方向 (定向克隆 ) Bam HⅠ 切割反應 GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 載體 DNA用 Bam HⅠ 切割 重組體 載體自連 目的基因自連 同一限制酶切位點連接 不同限制酶切位點的連接 Eco RⅠ 切割位點 Bg lⅡ 切割位點 + EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 2. 平齊末端連接 優(yōu)點：可連接任何一對 DNA 可恢復一個酶切位點或產(chǎn)生一個新酶 切位點 缺點：連接率低 要求連接酶及底物濃度高 GAA ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＡＧ GAAＴＴＣ 3. 同聚物核苷酸末端法 ? 在 DNA或 RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。 ? 應用末端轉移酶在 DNA片段 3′ 末端制備粘末端。 ? 避免自身環(huán)化 ? 互補序列較長時（ 4bp)，不需連接酶 4. TA克隆 ?Tvector兩條鏈的 5’ 端含有一個游離的 T ?PCR過程中增加延伸時間，Taq酶可在產(chǎn)物的 3’ 端多加一個 A 受體菌條件 安全宿主菌
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