【正文】 3噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 基因 VIII和基因 III、基因 II和基因 IV之間的間隔區(qū)較長(zhǎng)，其他基因間隔區(qū)只有數(shù)個(gè)核苷酸。 四、 M13噬菌體載體的缺點(diǎn) ①插入的外源 DNA片段不穩(wěn)定，片段越大，越容易發(fā)生缺失或重排。如基因 克隆、基因定點(diǎn)突變、 DNA測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄等 在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有 T7噬菌體啟動(dòng)子 ，可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 ④具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。如pWE1 pWE16等。 黏粒載體主要用于真核生物的基因組文庫(kù)構(gòu)建。 P1派生人工染色體 (PAC) P1噬菌體載體 PAC載體 F1 Replicon 克隆容量 ： 100~300kb 特點(diǎn) ： 單拷貝，克隆穩(wěn)定 哺乳動(dòng)物人工染色體 (MAC) 結(jié)構(gòu)組成 ： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體的復(fù)制起始區(qū)、端粒、著絲粒。 Genome map and expression of TMV Genome map and expression of PVX 三、動(dòng)物基因工程載體 動(dòng)物基因工程載體主要是由動(dòng)物病毒構(gòu)建的一類載體。在構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，保留病毒基因組的順式作用序列，用外源基因替代病毒的反式作用序列，取代的外源 DNA片段可長(zhǎng)達(dá) 7kb。主要是將外源基因插入到病毒的胸腺嘧啶核苷激酶基因 (tk基因 )克隆位點(diǎn)，用胸苷類似物 5溴脫氧尿苷進(jìn)行負(fù)篩選。 早期轉(zhuǎn)錄單位： E1a、 E1b、 E2a、 E2b、 E E4(E2b編碼末端蛋白和復(fù)制酶 ) 晚期轉(zhuǎn)錄單位： MLT(L L L L L5) 包裝位點(diǎn)： ψ 其他基因： VA、 plX、 IVa2 第六節(jié) 表達(dá)載體 一、表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則 閱讀框架與外源基因高效表達(dá) 表達(dá)載體一般都有三種變體，以適用于具不同閱讀框架酶切位點(diǎn)的基因表達(dá)。 有效的翻譯起始與外源基因高效表達(dá) 原核生物表達(dá)載體：①起始密碼優(yōu)先為 AUG；② 在起始密碼前具有 SD序列；③ SD序列與起始密碼之間的距離為 9177。 二、植物表達(dá)載體 啟動(dòng)子 ① 組成型啟動(dòng)子 花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動(dòng)子 、 胭脂堿合成酶基因(Nos)啟動(dòng)子 、 章魚堿合成酶基因 (Ocs)啟動(dòng)子 (見(jiàn)下圖 )。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子除具有真核生物啟動(dòng)子的一般結(jié)構(gòu)外，還具有相應(yīng)的 應(yīng)答元件 . 選擇標(biāo)記和報(bào)告基因 必備條件 ： a、不存在于正常植物細(xì)胞中； b、較小，可構(gòu)成嵌合基因； c、能在轉(zhuǎn)化體中高效表達(dá)； d、具有相應(yīng)的有效選擇劑，或容易檢測(cè)，并能定量分析。 大多數(shù)植物在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段并不具 GUS活性，但在果實(shí)、種皮、胚乳和胚中卻 明顯具有 GUS活性。 ①冠癭堿合成酶基因 章魚堿合成酶基因 (Ocs)、胭脂堿合成酶基因 (Nos)等。 組織特異性啟動(dòng)子除具有真核生物啟動(dòng)子的一般結(jié)構(gòu)外，同時(shí)往往還有增強(qiáng)子和沉默子。 使用誘導(dǎo)啟動(dòng)子 合理地調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。 轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達(dá) ① 除去衰減子； ② 插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列； ③ 強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列；原核生物一般 用 rrnB。 構(gòu)建腺病毒載體的基本原則是缺失 E E E3基因序列，保留其 1~2個(gè)酶切位點(diǎn)，供外源基因插入或取代。 痘苗病毒能在宿主的細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立地復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，不會(huì)致瘤，表達(dá)產(chǎn)物常被修飾， 而且易于培養(yǎng)，高度穩(wěn)定，宿主范圍廣。 T7 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 原病毒基因組 病毒基因組 PB：復(fù)制時(shí)引物結(jié)合位點(diǎn)； ψ：包裝信號(hào)； gag：結(jié)構(gòu)蛋白； pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶； env：病毒外殼蛋白； LTR：長(zhǎng)末端重復(fù)序列，含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及 poly(A)信號(hào)等順式作用序列。 ③ 、 RNA病毒轉(zhuǎn)化載體 基本操作方法 ： a、病毒 RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈 cDNA； b、單鏈 cDNA合成雙鏈 cDNA； c、將雙鏈 cDNA克隆到質(zhì)粒、 Cosmid中； d、然后將外源基因插入到克隆在質(zhì)粒的病毒 cDNA中； e、通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒 外源基因的 嵌合 RNA去感染植物。 細(xì)菌人工染色體 (BAC) kb 來(lái)源于 F質(zhì)粒。 解決方案 是將局部消化產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分級(jí)分離，獲得長(zhǎng)度為 31~45kbDNA片段。如 pcos1EMBL，與 colE1之間缺乏同源性。 ③黏粒載體的分子量較小， 克隆容量大 。當(dāng)輔助噬菌體存在時(shí)，按 M13噬菌體的滾環(huán)復(fù)制模型進(jìn)行復(fù)制產(chǎn)生單鏈 DNA分子。 M13mp7~1 M13mp18和 M13mp19等是在 M13mp2的EcoRI位點(diǎn)引入人工合成的多克隆位點(diǎn)。④可從大腸桿菌中制備雙鏈的復(fù)制型 DNA，如同質(zhì)粒一樣，能在體外進(jìn)行基因克隆操作。當(dāng)其缺失 red、 gam基因，就能在 P2溶源菌中能生長(zhǎng)并形成噬菌斑，便獲得 Spi表型 。基因 ，其中帶有多克隆位點(diǎn)。 根據(jù)克隆位點(diǎn)數(shù)，可將 λ噬菌體載體分為 插入型載體(insertion vectors)和 取代型載體 (replacement vectors， 置換型載體 )。如 pGEM系列質(zhì)粒載體： 穿梭質(zhì)粒載體 (shuttle plasmid vector) 穿梭質(zhì)粒載體 是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。如：pBR322及其派生質(zhì)粒載體、 pUC系列載體、 T載體。 4 R1drd19 (Tn3) pMB1 pMB3 pMB8 pSC101 pMB9 pBR312 pBR313 pBR320 1 1 2 3 3 4 5 6 pSF2124 (Tn3) pBR318 7 pBR322 8 pBR322的改良 ①進(jìn)一步降低載體的大小；如 pAT15 pXf3等。見(jiàn)下圖 彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個(gè) 不親和群 (ColE1/pMB1)，而彼此能夠共存的親和的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群 (p15A/ ColE1或 pMB1)。 一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性 質(zhì)粒是染色體外能自我復(fù)制的小型 DNA分子，大小為1~200kb以上。 必備基本條件 ： ①能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自主復(fù)制； ②具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)； ③具有合適的選擇標(biāo)記基因。 提取的質(zhì)粒有三種構(gòu)型：① 閉合環(huán)形DNA(超螺旋構(gòu)型 )，② 開(kāi)環(huán)形 DNA，③ 線形 DNA