基因工程技術(shù)與應(yīng)用知識(shí)點(diǎn)(更新版)
【正文】 。指專(zhuān)用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的載體，可將重組體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸。引起星活性原因：若使用buffer不當(dāng), 會(huì)有star activity，而star activity是指限制酶對(duì)所作用的DNA及序列失去專(zhuān)一性, 當(dāng)酶辨認(rèn)切割位置的能力降低，導(dǎo)致相似的序列或是錯(cuò)誤的辨認(rèn)序列長(zhǎng)度也會(huì)作用，而產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核酸酶?；蚬こ痰亩x：按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，特別是酶學(xué)技術(shù)，對(duì)遺傳物質(zhì)DNA直接進(jìn)行體外重組操作與改造，將一種生物（供體）的基因轉(zhuǎn)移到另外一種生物（受體）中去，從而實(shí)現(xiàn)受體生物的定向改造與改良。限制性核酸內(nèi)切酶。星活性：指限制性?xún)?nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，對(duì)與識(shí)別序列相似的其它序列也進(jìn)行切割反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的DNA片段的現(xiàn)象。末端轉(zhuǎn)移酶：不依賴(lài)于DNA的DNA聚合酶，來(lái)自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3162。表達(dá)載體。接合質(zhì)粒。）、細(xì)菌人工染色體(BAC)、源于噬菌體P1的人工染色體(PAC)，它們的特點(diǎn)是載體的容載能力擴(kuò)大,人工染色體具備三個(gè)元件：復(fù)制起始區(qū)/自主復(fù)制序列，參與染色體DNA復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成；著絲粒，負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞傳遞?；蛭膸?kù)：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建步驟：分離純化總RNA及mRNA（P104110）、cDNA第一鏈的合成、雙鏈cDNA合成、與載體重組、轉(zhuǎn)化從基因文庫(kù)中獲取目的基因的方法：PCR法、化學(xué)合成法、分離目的基因的方法和原理：1從生物基因組群體中分離目的基因（原核生物基因組較小,基因容易定位,用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組切成若干段后,用帶有標(biāo)記的核酸探針,.）2人工合成目的基因DNA片段（.）3 PCR反應(yīng)合成DNA（PCR是以DNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計(jì)）受體細(xì)胞選擇的原則；?外源DNA分子能穩(wěn)定存在，限制酶缺陷型；?重組基因缺陷型；?易于轉(zhuǎn)化/ 轉(zhuǎn)導(dǎo)；?易篩選?遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)；?安全性高；?內(nèi)源蛋白酶基因缺失或缺陷；?遺傳密碼無(wú)明顯偏好性；?具有較好的轉(zhuǎn)譯加工機(jī)制；?較高的理論和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。2電激法?原理：利用高壓電脈沖作用，在細(xì)菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，促進(jìn)外源DNA的有效吸收。α互補(bǔ)：lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體lacZ’可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β半乳糖苷酶陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。E. coli缺乏切除內(nèi)元的機(jī)制。包涵體：一定條件下，外源基因表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無(wú)膜的裸露結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為包涵
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