基因工程技術(shù)與應(yīng)用知識點(diǎn)-文庫吧資料
2024-08-18 04:40本頁面
【正文】 體細(xì)胞的過程。原位雜交技術(shù)：基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補(bǔ)配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。但形成的大多數(shù)分子對由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。探針雜交原理。以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDNA文庫。是指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定基因或DNA片段。探針：具有一定序列的核苷酸片段，能與互補(bǔ)的核酸序列復(fù)性雜交，并且能通過適當(dāng)標(biāo)記進(jìn)行檢測。②退火：（60℃65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。端粒, 對染色體DNA兩個(gè)末端起封口和保護(hù)作用。主要有酵母人工染色體（YAC，在大規(guī)模的測序中例如人類基因組計(jì)劃是非常有用的還有用于高等生物構(gòu)建基因組文庫，缺點(diǎn)是：1存在嵌合現(xiàn)象，嵌合體比例比較高，2 YAC 克隆的穩(wěn)定性差, 插入片段存在重排和丟失現(xiàn)象，3插入片段的分離和純化困難，不容易與酵母自身染色體相分離。在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。cos位點(diǎn)：指在連接酶的作用下，連接黏性末端結(jié)合形成的雙鏈DNA區(qū)段。指質(zhì)粒所攜帶的基因的功能是使細(xì)胞彼此有效地接觸，以便將質(zhì)粒DNA從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的質(zhì)粒。質(zhì)粒不親和性：指在無選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一個(gè)寄主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。松弛型質(zhì)粒:拷貝數(shù)多于10個(gè)的質(zhì)粒。主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：指獨(dú)立存在于宿主細(xì)胞染色體外、能夠自我復(fù)制的DNA分子。指專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的載體，可將重組體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。功能：1運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條作為工程載體必備的條件：具有多個(gè)單一的限制酶切位點(diǎn)；有復(fù)制起點(diǎn)，在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記基因；安全，不含對受體細(xì)胞有害的基因，不會任意轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞以外的其它生物細(xì)胞中；分子量小，拷貝數(shù)多；攜帶外源基因的幅度寬。防止載體分子的自身環(huán)化作用：使用不同的限制酶切；堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體；DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接。端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸。RNA 聚合酶：以DNA為模板合成mRNA，不需引物，但必須有啟動子。其一端或兩端具有一種或兩種內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端。以中線為軸兩邊對稱，其上有一種或幾種限制性核酸
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