基因工程-7章pcr技術(shù)及其應(yīng)用(編輯修改稿)
2024-10-08 21:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 目的基因上游引物設(shè)計(jì) 目的基因下游引物設(shè)計(jì) 2022/9/20 41 ㈤ PCR一般循環(huán)參數(shù) (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 ,95℃ 3～ 5分鐘 (2)退火 溫度由引物長(zhǎng)度和 GC含量決定 , 適宜的退火溫度大約低于引物 Tm值 4555℃ ，介于 4555℃ 。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 Tm值 就是 DNA熔解溫度，指把 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度。 Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） 2022/9/20 42 （ 3）延伸 72℃ ，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度 一般為 2535次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加 ㈥標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)條件： ? 10 緩沖液 10 μL ? 4種 dNTP混合物 各 200umol/L ?引物 各 10～ 100pmol ?模板 DNA ～ 2μg ? Taq DNA聚合酶 ? Mg 2+ 2022/9/20 43 2022/9/20 44 PCR儀 2022/9/20 45 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 46 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 47 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 48 72℃ 第 1輪結(jié)束 第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 49 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 50 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 51 重復(fù) 30輪后 230=1,073,741,824 模板 DNA 第 1輪擴(kuò)增 第 2輪擴(kuò)增 第 3輪擴(kuò)增 第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增 第 6輪擴(kuò)增 理想拷貝數(shù) =2n n 循環(huán)次數(shù) 實(shí)際拷貝數(shù) =(1+x)n X 平均效率 ,約為 n 循環(huán)次數(shù) 附圖 ㈦ PCR反應(yīng)注意的事項(xiàng) （一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及 EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 （ 二）設(shè)立對(duì)照 ： 陽性對(duì)照： 陽性模板 陰性對(duì)照： 陰性模板 試劑對(duì)照： 除模板外的所有組分 2022/9/20 52 ㈧ PCR反應(yīng)的特點(diǎn) ? 靈敏度高 1. 皮克 (pg=1012)量級(jí)擴(kuò)增到微克 (ug=106)水平 2. 能從 100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞 3. 病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá) 3個(gè) RFU（空斑形成單位） 4. 細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為 3個(gè)細(xì)菌 ? 簡(jiǎn)便、快速 1. 一次性加好反應(yīng)液， 2～ 4 h完成擴(kuò)增 2. 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析 ? 對(duì)標(biāo)本的純度要求低 ? 血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提 DNA 2022/9/20 53 反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR) 反向 PCR 復(fù)合 PCR 不對(duì)稱 PCR 嵌套 PCR 3’Full RACE 5’Full RACE 實(shí)時(shí)定量 PCR 2022/9/20 55 二、 PCR技術(shù)的主要類型 反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR) 是指以 mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的 PCR。 用于測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變 ,呈現(xiàn) mRNA多態(tài)性 ,克隆mRNA的 5’和 3’末端序列 ,以及從非常少量的 mRNA樣品構(gòu)建大容量的 cDNA文庫。 2022/9/20 56 2022/9/20 57 反轉(zhuǎn)錄酶具有依賴于 RNA的 DNA聚合酶活性和RNA酶 H活性， AMV(42℃ )和 MMLV（ 37℃ ）。 雙向外切 DNARNA雜合鏈中的 RNA鏈 2022/9/20 58 2022/9/20 59 5’ 3’ AAAAA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 539。 3’ 339。 5’ 5’ 3’ RTPCR 原理 mRNA 1st cDNA 反 轉(zhuǎn)錄酶、 下游引物、 dNTPs Taq DNA聚合酶 、 上游及下游引物、 dNTPs 5’ 5’ 3’ 3’ 特異 PCR 產(chǎn)物 5’ 5’ 3’ 3’ 經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生 230 個(gè)分子拷貝 5’ 5’ 3’ 3’ 2022/9/20 60 MLV RT催化的 cDNA合成 RTPCR引物選擇 2022/9/20 63 反向 PCR (reverse PCR) 是用反向引物對(duì)某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)未知序列進(jìn)行的 PCR。 可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析
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