【正文】 白類。 ? 基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制 。這種熱變性 復(fù)性 延伸的過程就是一個 PCR循環(huán)， PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 ② 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) ， 避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu) ， 使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 。 可對未知序列擴增后進行分析 ,如探索鄰接已知 DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長 cDNA的克隆 ,擴增基因文庫的插入 DNA。 2022/9/20 80 2022/9/20 81 ? 工作原理是 利用 Taq酶的 5’→3’ 外切酶活性。 H u m a n H M G B 1 P 0 9 4 2 9 M o u s e H M G B 1 P 6 3 1 5 8 C h i c k H M G B 1 Q 9 P U K 9 F r o g H M G B 1 Q 7 S Z 4 2 H u m a n H M G B 2 P 2 6 5 8 3 M o u s e H M G B 2 P 3 0 6 8 1 C h i c k H M G B 2 P 2 6 5 8 4 F r o g H M G B 2 Q 3 2 N S 7 H u m a n H M G B 3 O 1 5 3 4 7 M o u s e H M G B 3 O 5 4 8 7 9 C h i c k H M G B 3 P 4 0 6 1 8 F r o g H M G B 3 O 5 4 8 7 9 L j H M G B 1 H Q 6 1 5 9 9 1 A m p h i H M G 1 / 2 Q 6 P U E 4 S e a u r c h i n H M G 1 P 4 0 6 4 4物種進化圖 2022/9/20 94 要求將下面基因片段克隆至表達載體 pET28a相應(yīng)位點上，并獲得此基因的表達。 2. 醫(yī)學(xué) ⑴ 感染性疾病病原體的診斷： HIV、 結(jié)核桿菌、乙肝病毒等。 以參照物為標準，對 PCR終產(chǎn)物進行分析或?qū)?PCR過程進行監(jiān)測，從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量 PCR。 Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） 2022/9/20 42 （ 3）延伸 72℃ ，延伸時間由擴增片段長度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度 一般為 2535次 次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加 ㈥標準的 PCR反應(yīng)條件： ? 10 緩沖液 10 μL ? 4種 dNTP混合物 各 200umol/L ?引物 各 10～ 100pmol ?模板 DNA ～ 2μg ? Taq DNA聚合酶 ? Mg 2+ 2022/9/20 43 2022/9/20 44 PCR儀 2022/9/20 45 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 2022/9/20 46 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 2022/9/20 47 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 2022/9/20 48 72℃ 第 1輪結(jié)束 第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 2022/9/20 49 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 2022/9/20 50 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 2022/9/20 51 重復(fù) 30輪后 230=1,073,741,824 模板 DNA 第 1輪擴增 第 2輪擴增 第 3輪擴增 第 4輪擴增 第 5輪擴增 第 6輪擴增 理想拷貝數(shù) =2n n 循環(huán)次數(shù) 實際拷貝數(shù) =(1+x)n X 平均效率 ,約為 n 循環(huán)次數(shù) 附圖 ㈦ PCR反應(yīng)注意的事項 （一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及 EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 （ 二）設(shè)立對照 ： 陽性對照： 陽性模板 陰性對照： 陰性模板 試劑對照： 除模板外的所有組分 2022/9/20 52 ㈧ PCR反應(yīng)的特點 ? 靈敏度高 1. 皮克 (pg=1012)量級擴增到微克 (ug=106)水平 2. 能從 100萬個細胞中檢出一個靶細胞 3. 病毒檢測的靈敏度可達 3個 RFU（空斑形成單位） 4. 細菌檢測的最小檢出率為 3個細菌 ? 簡便、快速 1. 一次性加好反應(yīng)液， 2～ 4 h完成擴增 2. 擴增產(chǎn)物一般用電泳分析 ? 對標本的純度要求低 ? 血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提 DNA 2022/9/20 53 反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR) 反向 PCR 復(fù)合 PCR 不對稱 PCR 嵌套 PCR 3’Full RACE 5’Full RACE 實時定量 PCR 2022/9/20 55 二、