基因工程-7章pcr技術(shù)及其應用-在線瀏覽
2024-10-22 21:09本頁面
【正文】 DNA模板加熱 變性 解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生 退火 ，再將溫度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。 2022/9/20 16 2022/9/20 17 PCR Cycle Step 1 Denaturation Template DNA by Heat (95℃ ) 2022/9/20 18 Target Sequence Target Sequence PCR原理示意圖 ①模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 9395℃ 左右一定時間后 ,使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離 ,使之成為單鏈 ,以便它與引物結(jié)合 ,為下輪反應作準備； PCR Cycle Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences 2022/9/20 19 ②模板 DNA與引物的退火 (復性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后 ,溫度降至 55℃ 左右 ,引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； PCR Cycle Step 3 At 72 ℃ Taq DNA polymerase catalyses primer extension as plementary nucleotides are incorporated 2022/9/20 20 ③引物的延伸：DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈。 2022/9/20 22 被擴增的 DNA片段 模板 DNA 變性 引物與模板退火 引物延伸 模板 DNA變性 引物與模板退火 引物延伸 引物延伸 循環(huán) 1 循環(huán) 2 循環(huán) 3 模板 DNA 變性 引物與模板退火 21＝ 2 22＝ 4 23＝ 8 25次循環(huán)后，被擴增的 DNA片段的拷貝數(shù)為 225 附圖 Target Amplification Target Amplification 2022/9/20 23 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 2022/9/20 24 ㈢ PCR反應體系 緩沖溶液 (Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑 ) 耐熱 DNA聚合酶 脫氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs) 模板 DNA或 cDNA 上游引物、下游引物 2022/9/20 25 （ 1） PCR反應緩沖液 Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。 Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應特異性。 2022/9/20 26 （ 2） Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) U/100?L 酶量增加使反應特異性下降 。 2022/9/20 27 （ 3） dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種 dNTP濃度應相等 ,一般為 50200?mol/L 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量 dNTP可與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度下降，影響 DNA聚合酶的活性。 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、 DNA結(jié)合蛋白類。 模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。 ㈣ PCR引物的設計一般原則 ① 引物長度一般以 15～ 30bp為宜 ,過短則降低特異性 ， 過長則會引起引物間退火而影響有效擴增 。 ③ G/C和 A/T堿基均勻分布 ， G/C含量在 45～ 55%之間 ， 引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布 ， 避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列 。 ⑤ 引物 3′末端堿基一般應與模板 DNA嚴格配對 ， 并且 3′末端為 G、 C或 T時引物效率較高 。 ⑦ 引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。 Tm值 就是 DNA熔解溫度，指把 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。 用于測定基因表達的強度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變 ,呈現(xiàn) mRNA多態(tài)性 ,克隆mRNA的 5’和 3’末端序列 ,以及從非常少量的 mRNA樣品構(gòu)建大容量的 cDNA文庫。 雙向外切 DNARNA雜合鏈中的 RNA鏈 2022/9/20 58 2022/9/20 59 5’ 3’ AAAAA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 539。 5’ 5’ 3’ RTPCR 原理 mRNA 1st cDNA 反 轉(zhuǎn)錄酶、 下游引物、 dNTPs Taq DNA聚合酶 、 上游及下游引物、 dNTPs 5’ 5’ 3’ 3’ 特異 PCR 產(chǎn)物 5’ 5’ 3’ 3’ 經(jīng) 30 個循環(huán)，產(chǎn)生 230 個分子拷貝 5’ 5’ 3’ 3’ 2022/9/20 60 MLV RT催化的 cDNA合成 RTPCR引物選擇 2022/9/20 63 反向 PCR (reverse PCR) 是用反向引物對某個已知
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1