基因工程-7章pcr技術(shù)及其應(yīng)用(文件)
【正文】 基因組 DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 2022/9/20 67 高濃度引物 低濃度引物 嵌套 PCR(或稱(chēng)巢式 PCR) ?是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的 PCR。用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。 3’ 339。 Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） 2022/9/20 42 （ 3）延伸 72℃ ，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度 一般為 2535次 次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加 ㈥標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)條件： ? 10 緩沖液 10 μL ? 4種 dNTP混合物 各 200umol/L ?引物 各 10～ 100pmol ?模板 DNA ～ 2μg ? Taq DNA聚合酶 ? Mg 2+ 2022/9/20 43 2022/9/20 44 PCR儀 2022/9/20 45 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 46 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 47 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 48 72℃ 第 1輪結(jié)束 第 2輪開(kāi)始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 49 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 50 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 2022/9/20 51 重復(fù) 30輪后 230=1,073,741,824 模板 DNA 第 1輪擴(kuò)增 第 2輪擴(kuò)增 第 3輪擴(kuò)增 第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增 第 6輪擴(kuò)增 理想拷貝數(shù) =2n n 循環(huán)次數(shù) 實(shí)際拷貝數(shù) =(1+x)n X 平均效率 ,約為 n 循環(huán)次數(shù) 附圖 ㈦ PCR反應(yīng)注意的事項(xiàng) （一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及 EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開(kāi)，無(wú)菌操作 （ 二）設(shè)立對(duì)照 ： 陽(yáng)性對(duì)照： 陽(yáng)性模板 陰性對(duì)照： 陰性模板 試劑對(duì)照： 除模板外的所有組分 2022/9/20 52 ㈧ PCR反應(yīng)的特點(diǎn) ? 靈敏度高 1. 皮克 (pg=1012)量級(jí)擴(kuò)增到微克 (ug=106)水平 2. 能從 100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞 3. 病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá) 3個(gè) RFU（空斑形成單位） 4. 細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為 3個(gè)細(xì)菌 ? 簡(jiǎn)便、快速 1. 一次性加好反應(yīng)液， 2～ 4 h完成擴(kuò)增 2. 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析 ? 對(duì)標(biāo)本的純度要求低 ? 血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提 DNA 2022/9/20 53 反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR) 反向 PCR 復(fù)合 PCR 不對(duì)稱(chēng) PCR 嵌套 PCR 3’Full RACE 5’Full RACE 實(shí)時(shí)定量 PCR 2022/9/20 55 二、 PCR技術(shù)的主要類(lèi)型 反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR) 是指以 mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的 PCR。 2022/9/20 31 2022/9/20 32 例 1. 引物的 3’ 末端形成雜交 5’ GGCTATACCGATTCGAATCA 3’ 3’ ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5’ 例 2. 引物的 5’ 末端形成雜交 5’ ATCGATCGATGGCATGGTAT 3’ 3’ TATGGTACGGTAGCTAGCTA 5’ 例 3. 引物的中間部分形成雜交 5’ AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3’ 3’ AACGAGCTTCGATGGCTAA 5’ 例 4. 5’ CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3’ 引物設(shè)計(jì)軟件： Primer 5, Oligo6 目的基因上游引物設(shè)計(jì) 目的基因下游引物設(shè)計(jì) 2022/9/20 41 ㈤ PCR一般循環(huán)參數(shù) (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 ,95℃ 3～ 5分鐘 (2)退火 溫度由引物長(zhǎng)度和 GC含量決定 , 適宜的退火溫度大約低于引物 Tm值 4555℃ ，介于 4555℃ 。 2022/9/20 30 ④ 要避免兩個(gè)引物間特別是 3′末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身 3′末端堿基序列互補(bǔ)的 ， 使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu) 。 2022/9/20 29 （ 5）引物濃度 ?mol/L
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