【正文】 傳標(biāo)記基因； 3） 一個(gè) SUP4基因用于檢測重組子 ，其原理是： SUP4是 tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的 ade2赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色菌落，要是在 SUP4基因中插入外源 DNA片段后在轉(zhuǎn)化 ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 二、 l噬菌體載體的構(gòu)建 1. 縮短長度 ? 插入型載體 ? 該類載體經(jīng)改造后的長度為 37kb，有單一酶切位點(diǎn)，便于外源 DNA的插入。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 二、 l噬菌體載體的構(gòu)建 3. 構(gòu)建 琥珀型密碼子突變體 ? 終止密碼子有三種： UAA（赭石）； UGA（乳白）； UAG（琥珀） ? 琥珀型突變： CAGUAG（ stop） ? 將野生型 λ DNA上 A和 B兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG，當(dāng)這種 lDNA進(jìn)入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的 A和 B頭部蛋白，也就 不能被包裝，不能裂解細(xì)菌 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 Cosmid載體的特點(diǎn) 1. 具有 λ噬菌體的特性； 2. 具有質(zhì)粒載體的特性； 3. 具有較高容量的克隆能力； 4. 具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三節(jié) Cosmid載體 二、 Cosmid的構(gòu)建 ? Cosmid含有 lDNA兩端 cos區(qū)的質(zhì)粒。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三節(jié) Cosmid載體 三、 Cosmid的優(yōu)越性 1. 能象 lDNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 2. 可以裝載比質(zhì)粒或 lDNA大得多的外源 DNA片段，如 cos區(qū)及附近順序長為 kb，質(zhì)粒長為 ，則該 Cosmid最大可裝載 DNA 3. 由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選 4. 由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。 ? 噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內(nèi)孔將 DNA注入細(xì)菌體內(nèi)。 ? 可以定向地克隆 DNA片段 ， 克隆在 M13 RF DNA分子上的雙鏈 DNA片段 ， 到了子代噬菌體便成了單鏈的形式 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第四節(jié) 單鏈 DNA噬菌體 M13 二、 M13DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途 最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是它能使插入的外源 DNA片段變成單鏈， ? 單鏈 DNA的用途： ? 用于雙脫氧末端終止測定 DNA順序 ? 用于單鏈 DNA的定點(diǎn)誘變 ? 用于合成探針 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第四節(jié) 單鏈 DNA噬菌體 M13 二、 M13DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途 2. 篩選方便 ? 感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成渾濁圈，易于挑選辨認(rèn)而且重組分子越大，渾濁圈的渾濁度亦越大，這樣可以直接辨認(rèn)哪些菌落含有外源 DNA片段。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。 2） 非復(fù)制型 ：這類載體是在細(xì)菌克隆載體中插入一段病毒 DNA（不含復(fù)制起點(diǎn)）。 2. 組成 ： pMB1和病毒復(fù)制起點(diǎn)（如 SV40， BPV， EBV等），適合于細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。 當(dāng)含 SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒型載體或重組 DNA分子轉(zhuǎn)入 COS細(xì)胞后 (含有 SV40的 T抗原 )可大量復(fù)制 , 其拷貝數(shù)可達(dá) 2040萬。其中 T抗原參與 SV40的有效感染，并能特異地結(jié)合在病毒 DNA復(fù)制起點(diǎn)上，這種結(jié)合對(duì) DNA復(fù)制是必須的。這類載體特別適合于那些較大的病毒 DNA分子。 動(dòng)物分子克隆載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 （二） 病毒型載體 1. 特點(diǎn) 1) 可在動(dòng)物細(xì)胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構(gòu)成組分來自天然病毒或原病毒細(xì)胞） 2) DNA轉(zhuǎn)移效率高，但必須與天然 (輔助 )病毒共感染動(dòng)物細(xì)胞 3) 大多數(shù)被感染動(dòng)物細(xì)胞將是致死的，但有少數(shù)病毒（如逆病毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體 DNA中。 感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體 。 根據(jù) M13的生物學(xué)特性知道 ， M13子代噬菌體中總是只含有 （ ＋ ） 鏈 ， 所以 M13載體克隆的外源 DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有 DNA分子中的哪條鏈 ， 則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時(shí)的取向 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 M13載體 ? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS)，方便克隆。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接； ②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來專門選出 30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度； ③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。如果將這一小段 DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個(gè)重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源 DNA片段，同時(shí)它仍可象 lDNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與 λ噬菌體 DNA所不同的是，Cosmid不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞 ，它的制備與質(zhì)粒相同。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 三、 lDNA作為載體的優(yōu)點(diǎn) 1. lDNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌 2. lDNA作為載體，其裝載外源 DNA的能力為 25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 3. 重組 lDNA的篩選較為方便 4. 4. 重組 lDNA分子的提取比質(zhì)粒容易 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三節(jié) Cosmid載體 一、 Cosmid的定義 ? Cosmid（ cos site— carrying plasmid） ： 是一類由人工構(gòu)建的含有 lDNA兩端 cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體 。 ? 根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性分為兩種亞型： ? 免疫功能失活插入型載體 ? β －半乳糖苷酶失活插入型載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系