【正文】 ； d、然后將外源基因插入到克隆在質(zhì)粒的病毒 cDNA中； e、通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒 外源基因的 嵌合 RNA去感染植物。 SV40病毒載體 ① 取代型載體 包括 早期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代載體 和 晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代載體 。 T7 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 原病毒基因組 病毒基因組 PB：復(fù)制時(shí)引物結(jié)合位點(diǎn)； ψ：包裝信號(hào)； gag：結(jié)構(gòu)蛋白； pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶； env：病毒外殼蛋白； LTR：長末端重復(fù)序列，含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及 poly(A)信號(hào)等順式作用序列。 桿狀病毒載體 桿狀病毒載體是以 苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒 DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建的。 痘苗病毒能在宿主的細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立地復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，不會(huì)致瘤，表達(dá)產(chǎn)物常被修飾， 而且易于培養(yǎng)，高度穩(wěn)定，宿主范圍廣。 腺病毒載體 腺病毒為雙鏈 DNA病毒，病毒顆粒呈二十面體，其基因組 (見下圖 )大小為 35kb，在線性 DNA兩端為 100~150nt的反向末端重復(fù)序列 (ITR)， ITR為病毒復(fù)制所必需的。 構(gòu)建腺病毒載體的基本原則是缺失 E E E3基因序列，保留其 1~2個(gè)酶切位點(diǎn)，供外源基因插入或取代。 啟動(dòng)子與外源基因高效表達(dá) 轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要的限速步驟。 轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達(dá) ① 除去衰減子； ② 插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列； ③ 強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列；原核生物一般 用 rrnB。 真核細(xì)胞表達(dá)載體：起始密碼共有序列 5’CCA(G)CCATGG3’ 終止密碼與外源基因高效表達(dá) 原核生物表達(dá)載體： UAA，或幾個(gè)終止密碼串聯(lián)。 使用誘導(dǎo)啟動(dòng)子 合理地調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。 Nos啟動(dòng)子還表現(xiàn)出一定的組織特異性，在老組織內(nèi)通常比新生組織中強(qiáng)，在而且禾本科植物中幾乎沒有啟動(dòng)表達(dá)能力或表達(dá)能力很弱。 組織特異性啟動(dòng)子除具有真核生物啟動(dòng)子的一般結(jié)構(gòu)外，同時(shí)往往還有增強(qiáng)子和沉默子。 ① 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (NptII，來自 Tn5) 選擇劑： 卡那霉素 、慶大霉素、 G418等。 ①冠癭堿合成酶基因 章魚堿合成酶基因 (Ocs)、胭脂堿合成酶基因 (Nos)等。 。 大多數(shù)植物在營養(yǎng)生長階段并不具 GUS活性，但在果實(shí)、種皮、胚乳和胚中卻 明顯具有 GUS活性。 ② 雙氫葉酸脫氫酶突變基因 (DHFR，來自突變鼠 ) 選擇劑：氨甲蝶呤鈉 (毒性極大，能強(qiáng)烈抑制雙氫葉酸脫氫酶的活力，影響轉(zhuǎn)化頻率，一般不使用 ) ③ 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (HPT，來自細(xì)菌 ) 選擇劑： 潮霉素 (對(duì)多數(shù)植物有毒性，但在用卡那霉素不能進(jìn)行有效篩選時(shí)，以它作為選擇標(biāo)記顯得十分有用。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子除具有真核生物啟動(dòng)子的一般結(jié)構(gòu)外，還具有相應(yīng)的 應(yīng)答元件 . 選擇標(biāo)記和報(bào)告基因 必備條件 ： a、不存在于正常植物細(xì)胞中； b、較小，可構(gòu)成嵌合基因； c、能在轉(zhuǎn)化體中高效表達(dá)； d、具有相應(yīng)的有效選擇劑，或容易檢測(cè)，并能定量分析。 Nos啟動(dòng)子 /Ocs啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu) TATA盒 CAAT盒 TGACGTAAGCACATACGTCA 30~40bp處 60~80bp處 104~123bp處 六聚體基元的反向重復(fù) TATA盒 CAAT盒 TGACGT反向重復(fù)序列 增強(qiáng)子 A區(qū)： 90~+8bp B區(qū)： 343~ 90bp CaMV 35S啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu) A區(qū)主要負(fù)責(zé)在胚根及根組織內(nèi)表達(dá)， B區(qū)主要負(fù)責(zé)子葉、葉組織及維管組織內(nèi)表達(dá)。 二、植物表達(dá)載體 啟動(dòng)子 ① 組成型啟動(dòng)子 花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動(dòng)子 、 胭脂堿合成酶基因(Nos)啟動(dòng)子 、 章魚堿合成酶基因 (Ocs)啟動(dòng)子 (見下圖 )。 外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達(dá) ①構(gòu)建融合表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白；②構(gòu)建分泌表達(dá)載體，表達(dá)分泌蛋白。 有效的翻譯起始與外源基因高效表達(dá) 原核生物表達(dá)載體：①起始密碼優(yōu)先為 AUG；② 在起始密碼前具有 SD序列；③ SD序列與起始密碼之間的距離為 9177。 原核細(xì)胞表達(dá)載體常用的可誘導(dǎo)強(qiáng)啟動(dòng)子： Tac、 Trc、 Lac、 Trp、 λPL、 λPR、 phoA等。 早期轉(zhuǎn)錄單位： E1a、 E1b、 E2a、 E2b、 E E4(E2b編碼末端蛋白和復(fù)制酶 ) 晚期轉(zhuǎn)錄單位： MLT(L L L L L5) 包裝位點(diǎn)： ψ 其他基因： VA、 plX、 IVa2 第六節(jié) 表達(dá)載體 一、表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則 閱讀框架與外源基因高效表達(dá) 表達(dá)載體一般都有三種變體，以適用于具不同閱讀框架酶切位點(diǎn)的基因表達(dá)。 腺病毒內(nèi)通過宿主細(xì)胞的胞吞作用被有效吸收；其次腺病毒 DNA不整合到宿主染色體上，不會(huì)引起插入突變；再之可轉(zhuǎn)染分裂后的細(xì)胞，長期表達(dá)。主要是將外源基因插入到病毒的胸腺嘧啶核苷激酶基因 (tk基因 )克隆位點(diǎn)，用胸苷類似物 5溴脫氧尿苷進(jìn)行負(fù)篩選。因此，可將外源基因插入或取代多角體蛋白基因而構(gòu)建昆蟲細(xì)胞高表達(dá)載體。在構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，保留病毒基因組的順式作用序列，用外源基因替代病毒的反式作用序列，取代的外源 DNA片段可長達(dá) 7kb。但最大只能插入 DNA。 Genome map and expression of TMV Genome map and expression of PVX 三、動(dòng)物基因工程載體 動(dòng)物基因工程載體主要是由動(dòng)物病毒構(gòu)建的一類載體。 克隆容量： 250bp左右 The map of the CaMV genome ② 單鏈 DNA病毒轉(zhuǎn)化載體 (雙粒病毒 ) 雙粒病毒 Begomoviruses：兩個(gè)單鏈環(huán)狀 DNA分子，感染雙子葉植物，粉虱傳播，如 番茄金花葉病毒 (TGMV) Mastreviruses： 1個(gè)單鏈環(huán)狀 DNA分子，感染單子葉植物，葉蟬傳播，如 小麥矮化病毒 (WDV) WDV已發(fā)展為病毒轉(zhuǎn)化載體，外源基因取代基因 Ⅰ 、基因 Ⅱ 而不影響其復(fù)制。 P1派生人工染色體 (PAC) P1噬菌體載體 PAC載體 F1 Replicon 克隆容量 ： 100~300kb 特點(diǎn) ： 單拷貝，克隆穩(wěn)定 哺乳動(dòng)物人工染色體 (MAC) 結(jié)構(gòu)組成 ： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體的復(fù)制起始區(qū)、端粒、著絲粒。 克隆容量 ： 100~2022kb SUP4 kb YAC的優(yōu)點(diǎn) ： 克隆容量大，構(gòu)建的基因組文