【正文】 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 Taq酶 PCR Reverse transcription (RT) 下游引物 上游引物 Taq酶 (5)巢式 PCR（ NestPCR） 巢式 PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。 原位 PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值。 設(shè)計(jì)引物定點(diǎn)誘變 利用 6bp長度的 隨機(jī)序列引物 擴(kuò)增細(xì)胞中的總 DNA，將會(huì)得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。但當(dāng)時(shí)在認(rèn)識(shí)上和技術(shù)上存在兩個(gè)問題： 1. 當(dāng)時(shí)沒有能把不同長度的 核苷酸片段分離開 的技術(shù)。 Sanger等 1977年發(fā)明。 （ 4） 2’和 3’雙脫氧的 ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終 止。 需帶有 放射性或熒光標(biāo)記 。 Sanger測序法讀出的序列是 新合成 的互補(bǔ)鏈序列。 (三 )、 DNA雜交測序 （ 2）有個(gè)別不互補(bǔ)堿基時(shí)，雜交效率下降。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一種 探針完全雜交形成 完全互補(bǔ) 雙鏈。 8mer探針有 48= 65536 種序列。 （ 1） DNA芯片（ chip） 把寡聚核苷酸探針的 3 ’端或 5’端與玻璃或凝膠形成共價(jià)連接。 (四 )、 DNA自動(dòng)化測序 熒光物質(zhì)標(biāo)記。 （ 2）反應(yīng)的自動(dòng)化 Sanger脫氧終止法。 3. 熒光標(biāo)記 ddNTP自動(dòng)測序原理圖解 4種不同的熒光物分別標(biāo)記 4種 ddNTP。而 2022年代的高通量測序儀可達(dá)到月測序 16 Mbp！ Illumina / Solexa Geic Analyzer 2022 Mb / run Applied Biosystems ABI 3730XL 1 Mb / day Roche / 454 Genome Sequencer FLX 100 Mb / run Applied Biosystems SOLiD 3000 Mb / run 高通量 DNA序列分析技術(shù) 。 測序結(jié)果 高通量 DNA序列分析技術(shù) ? 人類基因組計(jì)劃的成功很大程度上得益于有效減少 DNA測序成本的技術(shù)更新。 （ 5）反應(yīng)可在一個(gè)試管中進(jìn)行 標(biāo)記 ddNTP時(shí)。 1. 技術(shù)要點(diǎn) （ 2）不同的標(biāo)記對象 既可標(biāo)記 引物 ，也可標(biāo)記 ddNTP。 2. 技術(shù)要點(diǎn) 每種探針的序列和位置已知，可被電腦讀出。 （ 5）根據(jù) 雜交效率 可推斷出靶 DNA的序列。 5’AGCCTAGC3’ Target 3’TCGGATCG5’ Probe 假如探針序列已知，則可推知靶 DNA序列。 （ 4）用一段寡居聚苷酸（ 8mer）的 所有可能的堿基排列序列 作探針。 1. 原理 （ 1）只有完全互補(bǔ)的 DNA序列才能雜交形 成完全的雙鏈分子。 (二 )、 MaxamGilbert化學(xué)修飾法 Walter Gilbert, 1980年 Nobel Prize化學(xué)獎(jiǎng) 末端放射性標(biāo)記 的 DNA片單鏈 長度只差一個(gè)核苷 酸的 DNA鏈混合物 化學(xué)試劑處理 凝膠電泳 放射性自顯影 閱讀堿基順序 特定的堿基中 引入化學(xué)基團(tuán) DNA在被修飾的 核苷酸位置斷裂 1. 原理 堿基 特異修飾方法 G ,用硫酸二甲脂對 N7進(jìn)行甲基化，使 C8C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性 A+G ,哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的 N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵 C+T 肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去 C 在 ，可用肼除去胞嘧啶 2. 堿基特異的化學(xué)修飾法 反應(yīng) 切割 堿基修飾 修飾堿基的轉(zhuǎn)移 DNA鏈的斷裂 R1 GA 硫酸二甲脂 氫氧化鈉 R2 AG 硫酸二甲脂 酸 氫氧化鈉 R3 C+T 肼 六氫吡啶 六氫吡啶 R4 C 肼 +鹽 六氫吡啶 六氫吡啶 R5 G 硫酸二甲脂 六氫吡啶 六氫吡啶 R6 G+A 酸 酸 六氫吡啶 R7 C+T 肼 六氫吡啶 六氫吡啶 R8 C 肼 +鹽 六氫吡啶 六氫吡啶 R9 AC 氫氧化鈉 六氫吡啶 六氫吡啶 R10 GA 硫酸二甲脂 六氫吡啶 R11 G 亞甲藍(lán) 六氫吡啶 六氫吡啶 R12 T 四氧化鋨 六氫吡啶 六氫吡啶 3. 堿基特異的化學(xué)切割法 4. 測序過程 每組反應(yīng)只針對特定的堿基，共有 4組反應(yīng)，可分別顯示 G、 A+G、 C、 C+T的終止位置。 ① 不能有 5’?3’和 3’?5’的外切酶活性； ② 與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。 （ 2）脫氧核糖的連接是以 3’?5’磷酸二脂鍵 。 五 DNA序列分析 （ 1965年 Cornell大學(xué)的 . Holley等首次測定了75bp的酵母丙氨酸 tRNA全序列。 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（ RFLP）分析。 關(guān)鍵：利用末端轉(zhuǎn)移酶在未知一端創(chuàng)造引物結(jié)合位點(diǎn) 已知序列 末端核酸轉(zhuǎn)移酶 3’GG…GG 5’ CC…CC 錨定引物 3’GG…GG 5’ CC…CC 3’GG…GG CC…CC 未知序列 5’ 3’ 7. PCR技術(shù)的應(yīng)用 （ 1）擴(kuò)增某一段 DNA 從基因組中擴(kuò)增； 從載體上擴(kuò)增； 組織樣本原位擴(kuò)增； 微量殘留 DNA擴(kuò)增； 分析模板序列； 在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。 RACE）的特異性。如 mRNA或 RNA病毒。最后產(chǎn)物中 99%是單鏈 DNA。 熒光強(qiáng)度 循環(huán)數(shù)曲線 初始模板量對數(shù) C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 104 103 106 105 102 10 設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ?通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量 unknown 104 103 Ct值 模板量 到達(dá)閾值的循環(huán)數(shù) 閾值 擴(kuò)增兩個(gè) 引物外側(cè) 的未知序列 （ 2）反向 PCR 把線性 DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。可以做到 PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定 CT值，從而根據(jù) Ct值 確定起始 DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的 DNA定量。 （ 6） Mg 2+ 的濃度 所以 Mg2+濃度不能太低。 dNTPs 是 dATP、 dTTP、 dCTP和dGTP的總稱。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 ⑦ 簡并引物 如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的 ，就必須考慮密碼的簡并性。 ⑤ 引物的 Tm值 Tm=（ G+C)?4 + (A+T)?2 當(dāng)引物中的（ G+C）含量低于 50%時(shí)，復(fù)性溫度低于 55 ℃ 。 template primer 盡可能提高 G+C含量 ，以提高引物與模板的結(jié)合力，堿基隨機(jī)分布 ,一般 G+C%含量宜在 4555%左右。 ② 引物的長度 理論計(jì)算： 419=?1011。 是 Taq和 Pfu DNA聚合酶的混合物