【正文】 9； Tn3 轉(zhuǎn)座到 pMB9上形成 pBR312； pBR312的 EcoRI*片段重排形成pBR313； pBR313的 EcoRII片段重排形成pBR320； pBR313的 PstI片段重排形成pBR318； pBR320的 PstI和 HincII雙酶切片段與 pBR318的 PstI和 HapI雙酶連接形成 pBR322。 BglII site of the MCS. pBAD/His的三種變體 (3種讀碼框 ) Myc： myc抗體的抗原決定簇 標簽為生物素羧化酶載體蛋白基因 鏈霉素親和層析柱 多功能質(zhì)粒載體 具有 克隆 、 表達 、 測序 、 體外轉(zhuǎn)錄 等多種功能，避免了重復操作。 ③ 引入適當?shù)倪x擇標記 在 λ噬菌體載體的非必需區(qū)段插入 LacZ39。③容易地測定出外源 DNA片段的插入方向。 ②在宿主細胞內(nèi)可按質(zhì)粒 DNA復制，形成的雙鏈 DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)。 ③構(gòu)建與常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體沒有同源性序列的黏粒載體。 YAC的缺點 ： ①用其克隆外源基因易出現(xiàn)嵌合體 (40％ ~60％的克隆是嵌合體，由于重組所致 )； ②某些克隆不穩(wěn)定，有從插入序列丟失其內(nèi)部區(qū)段的傾向 (由于重組所致 )；但可以通過將 YAC文庫轉(zhuǎn)化到重組缺失的宿主來減少嵌合體形成和不穩(wěn)定性的問題； ③ YAC克隆不容易與酵母自身染色體 (15Mb)相分離。 ② 混合型載體 SV40混合型載體 是帶有 SV40復制起點或調(diào)控序列及 T抗原基因的質(zhì)粒載體。因此， 腺病毒載體是一種良好的 基因治療載體 。 減輕細胞的代謝負荷 特別是毒性蛋白。對禾谷類作物它比 Kan選擇更有效 ) ④ 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (cat，來自 Tn9) 選擇劑： 氯霉素 (作為選擇標記并不理想，常作為報告基因 ) ⑤ 除草劑 PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (bar基因，來自放線菌 ) 選擇劑：膦絲菌素 (在禾谷類作物上比 Kan選擇更有效 ) (2) 報告基因 報告基因 是指用于檢測與其組裝在一起的外源基因在導入細胞后是否表達的一種指示基因。 (1) 選擇標記 相應選擇劑必須符合 ： a、能抑制未轉(zhuǎn)化細胞的正常生長，但并不殺死細胞，即毒性低； b、對轉(zhuǎn)化細胞生長和器官分化的影響不大。 3bp；④起始密碼前兩個核苷酸為 AU，即 AUAUG序列；⑤起始密碼后的序列為 GCAU或 AAAA序列；⑥在翻譯起始區(qū)應不形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。 用痘苗病毒載體表達的外源基因有：乙型肝炎表面抗原基因，流感病毒血凝素基因，狂犬病毒表面糖蛋白基因，以及單純皰疹病毒、 EB病毒、水泡性口炎病毒、偽狂犬病毒和瘧原蟲等有關(guān)抗原基因。 動物病毒侵入動物細胞后，呈現(xiàn)類似于噬菌體的兩類生長狀態(tài)，即裂解感染和整合性感染。由于其克隆容量大，可以減少基因組文庫的克隆數(shù)，提高篩選時陽性克隆的檢出率，大大地減少了工作量。 二、黏粒載體的構(gòu)建 黏粒載體都是在通用的克隆質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，引入cos序列以及其它一些序列構(gòu)建而成的。一般情況下其有效的最大克隆能力僅 。 第三節(jié) 單鏈 DNA噬菌體載體 M1 f fd是一類絲狀大腸桿菌噬菌體，都含有同源性很高的 DNA分子。 根據(jù)噬菌斑的混濁和清亮來區(qū)分重組體 取代型載體： 具有成對的克隆位點以使兩個位點之間的 DNA區(qū)段可以被外源 DNA片段取代的 λ噬菌體載體。② SD序列；③強終止子。 如 ColE1(必須具備 nic位點 、 mob基因 ) 二、理想質(zhì)粒載體必須具備的條件 天然質(zhì)粒用作載體的局限性 分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點少、選擇標記不合適。 必備基本條件 ： ①能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的自主復制； ②具有合適的限制性內(nèi)切酶位點； ③具有合適的選擇標記基因。見下圖 彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個 不親和群 (ColE1/pMB1)，而彼此能夠共存的親和的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群 (p15A/ ColE1或 pMB1)。如：pBR322及其派生質(zhì)粒載體、 pUC系列載體、 T載體。 根據(jù)克隆位點數(shù)，可將 λ噬菌體載體分為 插入型載體(insertion vectors)和 取代型載體 (replacement vectors， 置換型載體 )。當其缺失 red、 gam基因，就能在 P2溶源菌中能生長并形成噬菌斑，便獲得 Spi表型 。 M13mp7~1 M13mp18和 M13mp19等是在 M13mp2的EcoRI位點引入人工合成的多克隆位點。 ③黏粒載體的分子量較小， 克隆容量大 。 解決方案 是將局部消化產(chǎn)物通過凝膠電泳分級分離，獲得長度為 31~45kbDNA片段。 ③ 、 RNA病毒轉(zhuǎn)化載體 基本操作方法 ： a、病毒 RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈 cDNA； b、單鏈 cDNA合成雙鏈 cDNA； c、將雙鏈 cDNA克隆到質(zhì)粒、 Cosmid中； d、然后將外源基因插入到克隆在質(zhì)粒的病毒 cDNA中； e、通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒 外源基因的 嵌合 RNA去感染植物。 痘苗病毒能在宿主的細胞質(zhì)中獨立地復制和轉(zhuǎn)錄，不會致瘤，表達產(chǎn)物常被修飾， 而且易于培養(yǎng)，高度穩(wěn)定，宿主范圍廣。 轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達 ① 除去衰減子； ② 插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列； ③ 強轉(zhuǎn)錄終止序列；原核生物一般 用 rrnB。 組織特異性啟動子除具有真核生物啟動子的一般結(jié)構(gòu)外，同時往往還有增強子和沉默子。 大多數(shù)植物在營養(yǎng)生長階段并不具 GUS活性，但在果實、種皮、胚乳和胚中卻 明顯具有 GUS活性。 二、植物表達載體 啟動子 ① 組成型啟動子 花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動子 、 胭脂堿合成酶基因(Nos)啟動子 、 章魚堿合成酶基因 (Ocs)啟動子 (見下圖 )。 早期轉(zhuǎn)錄單位： E1a、 E1b、 E2a、 E2b、 E E4(E2b編碼末端蛋白和復制酶 ) 晚期轉(zhuǎn)錄單位： MLT(L L L L L5) 包裝位點： ψ 其他基因： VA、 plX、 IVa2 第六節(jié) 表達載體 一、表達載體構(gòu)建的一般原則 閱讀框架與外源基因高效表達 表達載體一般都有三種變體，以適用于具不同閱讀框架酶切位點的基因表達。在構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體時，保留病毒基因組的順式作用序列，用外源基因替代病毒的反式作用序列，取代