【正文】 反向末端重復序列 (ITR)， ITR為病毒復制所必需的。在宿主細胞核內(nèi)進行復制，以末端蛋白的絲氨酸殘基起始復制。 腺病毒內(nèi)通過宿主細胞的胞吞作用被有效吸收；其次腺病毒 DNA不整合到宿主染色體上，不會引起插入突變；再之可轉染分裂后的細胞，長期表達。因此， 腺病毒載體是一種良好的 基因治療載體 。 構建腺病毒載體的基本原則是缺失 E E E3基因序列，保留其 1~2個酶切位點，供外源基因插入或取代。腺病毒載體的最大克隆容量約 10kb。 早期轉錄單位： E1a、 E1b、 E2a、 E2b、 E E4(E2b編碼末端蛋白和復制酶 ) 晚期轉錄單位： MLT(L L L L L5) 包裝位點： ψ 其他基因： VA、 plX、 IVa2 第六節(jié) 表達載體 一、表達載體構建的一般原則 閱讀框架與外源基因高效表達 表達載體一般都有三種變體，以適用于具不同閱讀框架酶切位點的基因表達。 用人工接頭可以調(diào)節(jié)閱讀框架。 啟動子與外源基因高效表達 轉錄起始的速率是基因表達的主要的限速步驟。選擇強啟動子增強子是構建高效表達載體的首要問題。 原核細胞表達載體常用的可誘導強啟動子： Tac、 Trc、 Lac、 Trp、 λPL、 λPR、 phoA等。動物細胞表達載體常用的組成型啟動子： SV腺病毒、人巨細胞病毒和 Rous肉瘤病毒的啟動子及增強子。 轉錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達 ① 除去衰減子； ② 插入抗轉錄終止序列； ③ 強轉錄終止序列；原核生物一般 用 rrnB。 ④真核生物 poly(A) 位點。 有效的翻譯起始與外源基因高效表達 原核生物表達載體：①起始密碼優(yōu)先為 AUG；② 在起始密碼前具有 SD序列；③ SD序列與起始密碼之間的距離為 9177。 3bp；④起始密碼前兩個核苷酸為 AU，即 AUAUG序列；⑤起始密碼后的序列為 GCAU或 AAAA序列；⑥在翻譯起始區(qū)應不形成明顯的二級結構。 真核細胞表達載體：起始密碼共有序列 5’CCA(G)CCATGG3’ 終止密碼與外源基因高效表達 原核生物表達載體： UAA，或幾個終止密碼串聯(lián)。 密碼子選擇與 外源基因高效表達 消除基因中的限制密碼，以其他同義密碼替代。 外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達 ①構建融合表達載體，表達融合蛋白；②構建分泌表達載體，表達分泌蛋白。 減輕細胞的代謝負荷 特別是毒性蛋白。 使用誘導啟動子 合理地調(diào)節(jié)好宿主細胞的代謝負荷與外源基因高效表達的關系。如 pET載體 (見下圖 )。 二、植物表達載體 啟動子 ① 組成型啟動子 花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動子 、 胭脂堿合成酶基因(Nos)啟動子 、 章魚堿合成酶基因 (Ocs)啟動子 (見下圖 )。 Nos啟動子和 Ocs啟動子也具有一定的損傷誘導和激素誘導活性，六聚體基元反向重復序列為其必需的。 Nos啟動子還表現(xiàn)出一定的組織特異性，在老組織內(nèi)通常比新生組織中強，在而且禾本科植物中幾乎沒有啟動表達能力或表達能力很弱。 在雙子葉植物中， 35S啟動子比 Nos啟動子的轉錄水平高30倍。 Nos啟動子 /Ocs啟動子的結構 TATA盒 CAAT盒 TGACGTAAGCACATACGTCA 30~40bp處 60~80bp處 104~123bp處 六聚體基元的反向重復 TATA盒 CAAT盒 TGACGT反向重復序列 增強子 A區(qū)： 90~+8bp B區(qū)： 343~ 90bp CaMV 35S啟動子的結構 A區(qū)主要負責在胚根及根組織內(nèi)表達， B區(qū)主要負責子葉、葉組織及維管組織內(nèi)表達。 ② 組織特異型啟動子 馬鈴薯塊莖蛋白基因的啟動子、 小麥胚乳特異表達的ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動子，番茄果實成熟特異性表達的多聚半乳糖醛酸酶基因啟動子、煙草 TA29啟動子、木質(zhì)部特異表達的苯丙氨酸脂肪酶基因（ pal）啟動子。 組織特異性啟動子除具有真核生物啟動子的一般結構外，同時往往還有增強子和沉默子。 ③誘導型啟動子 光誘導啟動子 (核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因 )、 熱誘導啟動子 (果蠅 hsp70S基因 )、 創(chuàng)傷誘導啟動子 (蛋白酶抑制劑基因 )等。誘導型啟動子除具有真核生物啟動子的一般結構外，還具有相應的 應答元件 . 選擇標記和報告基因 必備條件 ： a、不存在于正常植物細胞中； b、較小，可構成嵌合基因； c、能在轉化體中高效表達； d、具有相應的有效選擇劑，或容易檢測，并能定量分析。 (1) 選擇標記 相應選擇劑必須符合 ： a、能抑制未轉化細胞的正常生長，但并不殺死細胞，即毒性低； b、對轉化細胞生長和器官分化的影響不大。 ① 新霉素磷酸轉移酶基因 (NptII，來自 Tn5) 選擇劑： 卡那霉素 、慶大霉素、 G418等。 對茄科、十字花科植物的轉化選擇特別有效，對豆科植物、單子葉植物選擇效果不佳。 ② 雙氫葉酸脫氫酶突變基因 (DHFR，來自突變鼠 ) 選擇劑：氨甲蝶呤鈉 (毒性極大，能強烈抑制雙氫葉酸脫氫酶的活力，影響轉化頻率，一般不使用 ) ③ 潮霉素磷酸轉移酶基因 (HPT，來自細菌 ) 選擇劑： 潮霉素 (對多數(shù)植物有毒性，但在用卡那霉素不能進行有效篩選時，以它作為選擇標記顯得十分有用。對禾谷類作物它比 Kan選擇更有效 ) ④ 氯霉素乙酰轉移酶基因 (cat，來自 Tn9) 選擇劑： 氯霉素 (作為選擇標記并不理想，常作為報告基因 ) ⑤ 除草劑 PPT乙酰轉移酶基因 (bar基因，來自放線菌 ) 選擇劑：膦絲菌素 (在禾谷類作物上比 Kan選擇更有效 ) (2) 報告基因 報告基因 是指用于檢測與其組裝在一起的外源基因在導入細胞后是否表達的一種指示基因。 ①冠癭堿合成酶基因 章魚堿合成酶基因 (Ocs)、胭脂堿合成酶基因 (Nos)等。 ② β葡萄糖苷酸酶基因 (GUS) β葡萄糖苷酸酶催化 5溴 4氯 3吲哚 β葡糖苷酸酯 (XGluc)形成蘭色產(chǎn)物，使表達的細胞或組織染成藍色。 大多數(shù)植物在營養(yǎng)生長階段并不具 GUS活性，但在果實、種皮、胚乳和胚中卻 明顯具有 GUS活性。 ③熒光素酶基因或 GFP基因 (3) 選擇標記基因和報告基因的選用策略 ①不同植物對選擇劑的敏感性不同； ②不同外植體對選擇劑的敏感性不同； ③植物是否有本底物存在。