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2025-09-11 18:26本頁面
【正文】 分子量、折疊途徑等）無直接關系。 因為大腸桿菌胞質(zhì)環(huán)境是一個還原性環(huán)境，所以含有較多二硫鍵的蛋白較容易錯誤折疊形成包涵體。 相比之下，周質(zhì)空間有利于二硫鍵的形成，但是包涵體的形成也會發(fā)生。包含體的產(chǎn)生有利有弊。 ? 包涵體的性質(zhì) ：致密（幾乎全部是過表達蛋白，雜質(zhì)主要是細菌外膜蛋白，離心時一起沉降）；通常對蛋白酶降解不敏感（發(fā)酵升溫至 42℃ 可促進包涵體形成并進一步抑制蛋白酶）。 ? 分離包涵體并復性蛋白質(zhì)的操作步驟并不復雜， 從破碎細胞開始，然后將細胞勻漿離心，回收包涵體后，加入變性劑溶解包涵體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達產(chǎn)物折疊恢復天然構象及活性。 20221030 33 基因工程下游技術 包涵體的分離、溶解和復性 溶菌酶處理 —高壓勻漿（細胞破碎效率較重要） 離心（固 液相分離） 去污劑或 /和低濃度尿素或鹽酸胍洗滌，去可溶性蛋白和膜蛋白 高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，可添加 DTT打開二硫鍵 逐步透析或稀釋去除變性劑 20221030 34 基因工程下游技術 2．細胞外周質(zhì)表達 ? 在細胞外周質(zhì)進行蛋白質(zhì)表達有許多優(yōu)越之處。 （ 1）在外周質(zhì)只有 4%的總細胞蛋白，這顯然有利于目的蛋白的純化 （ 2）外周質(zhì)的氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，在轉(zhuǎn)移到外周質(zhì)的過程中，信號肽在細胞內(nèi)剪切更有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然 N末端。 （ 3）此外，外周質(zhì)中的蛋白質(zhì)降解也少得多。 ? 但是，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到細菌外周質(zhì)是一個特別復雜和尚未完全明了的過程，信號肽的存在并不總能保證蛋白質(zhì)有效地通過內(nèi)膜。 20221030 35 基因工程下游技術 3. 細胞外分泌表達 將蛋白質(zhì)分泌到細胞外是人們最期望的一種策略。因為這樣容易純化目的蛋白質(zhì)，減少細菌的蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的降解。 20221030 36 基因工程下游技術 4. 融合蛋白表達 ? 在 ，尤其是真核蛋白時，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是經(jīng)常遇到的問題。最近幾年，眾多巧妙的蛋白質(zhì) ——融合系統(tǒng)的發(fā)展，為 。 ? 融合表達具有多方面的優(yōu)點： ? 防止包涵體的形成 ? 促進蛋白質(zhì)的正確折疊 ? 限制蛋白酶解和利于純化 20221030 37 基因工程下游技術 20221030 基因工程下游技術 38 ?融合表達體系 ?谷胱甘肽 S－轉(zhuǎn)移酶（ GST） ?麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） ?硫氧還蛋白（ Trx） ?融合蛋白中目的蛋白的回收 ?位點特異性裂解的方法： 溴化氰 (Met↓)、 羥胺(Asn↓Gly)等試劑或低 pH(Asp↓Pro)來進行融合蛋白的化學裂解。 ?酶解： 反應條件較溫和，所用蛋白酶具有高度的特異性，如凝血酶、腸激酶、凝乳酶和膠原酶等。所有這些酶都具有較長的底物識別序列，從而降低了蛋白質(zhì)中其他無關部位發(fā)生斷裂的可能性。 五、實例：粒細胞 —巨噬細胞集落刺激因子 (GMCSF)下游生產(chǎn)工藝流程 菌種劃板及擴菌 75L發(fā)酵罐擴菌誘導 ,流加補料 離心收集菌體 高壓勻漿破菌，洗滌提取包涵體 溶解包涵體， Sephacryl S200分子篩柱層析 復性 超濾濃縮， Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析 Superdex 75 Prep Grade分子篩柱層析 分裝、凍干 20221030 39 基因工程下游技術 六、外源基因表達產(chǎn)物的質(zhì)量檢測 工業(yè)化生產(chǎn)的重組蛋白必須經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制才能成為產(chǎn)品。重組蛋白的質(zhì)量控制指標包括： 重組蛋白的鑒別（序列） 重組蛋白的純度（雜質(zhì)的類型） 重組蛋白的活性（檢測方法） 重組蛋白的安全性 重組蛋白的穩(wěn)定性 重組蛋白的一致性（構象與構型） 重組蛋白產(chǎn)物的質(zhì)量檢測項目與方法 檢測項目 檢測方法 產(chǎn)品是否含內(nèi)毒素 家兔熱原法 蛋白質(zhì)是否變異 肽譜、 HPLC、 等電聚焦、毛細管電泳 甲硫氨酸是否被甲?；? 肽譜、質(zhì)譜、 HPLC、 Edman分析 蛋白質(zhì)是否變性、聚合、脫氨基 SDSPAGE、 凝膠層析、等電聚焦、質(zhì) 配體是否脫落 SDSPAGE、 免疫分析 氨基酸是否發(fā)生取代 氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜、毛細管電泳 產(chǎn)品是否被細菌、病毒、支原體等污染 微生物學檢測 譜、 HPLC、 毛細管電泳、 Edman分析
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