【正文】 庫(kù)克隆數(shù)少，能保持基因組特定序列的完整性，有利于制作物理圖譜。 黏粒載體主要用于真核生物的基因組文庫(kù)構(gòu)建。 ②在連接反應(yīng)中，酶切的基因組 DNA片段 (特別是較小的 DNA 片段 )往往會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)或數(shù)個(gè)片段隨機(jī)再連接，串聯(lián)地插入到載體上，其連接順序并不符合基因組中排列順序。如pWE1 pWE16等。如 pWE1 pWE16。 ④具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。當(dāng)然黏粒載體本身不能在體外被包裝，只有在克隆了合適長(zhǎng)度的外源 DNA片段，才能被包裝成噬菌體顆粒，這是對(duì)重組子的正選擇。如基因 克隆、基因定點(diǎn)突變、 DNA測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄等 在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有 T7噬菌體啟動(dòng)子 ，可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 噬菌粒載體的優(yōu)點(diǎn) ： ①分子量較小，約為 3kb，可克隆 10kb的外源 DNA片段。 四、 M13噬菌體載體的缺點(diǎn) ①插入的外源 DNA片段不穩(wěn)定，片段越大，越容易發(fā)生缺失或重排。 M13mp2 是利用點(diǎn)突變把 M13mp1的 ?肽的第 5個(gè)氨基酸密碼子中的鳥嘌呤轉(zhuǎn)換成腺嘌呤，從而引入了一個(gè) EcoRI限制酶切位點(diǎn)。 一、 M13噬菌體的一般生物學(xué)特性 M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 基因 VIII和基因 III、基因 II和基因 IV之間的間隔區(qū)較長(zhǎng)，其他基因間隔區(qū)只有數(shù)個(gè)核苷酸。②制備單鏈 DNA分子，用于基因定點(diǎn)突變、基因測(cè)序、雜交探針制備等。 λZAP插入型載體 在 λZAP中，含有一個(gè) pBluescript噬菌粒的 DNA片段 (見下圖 )，位于 J基因和 cI基因之間，兩側(cè)是 f1復(fù)制起始子和終止子 ，在輔助噬菌體 M13或 f1存在下，能獲得帶外源 DNA的噬菌粒，用于測(cè)序和限制圖譜構(gòu)建等 (其它 λ載體的缺陷 )。其 MCS含有 EcoRI、 SacI、 SmaI、 XbaI、 SalI、 PstI、 HindIII、BamHI λEMBL系列 取代型載體 如： λEMBL λEMBL λEMBL3A等。如Charon 4A是在晚期基因 A、 B中引入了琥珀突變 。 包裝限制是對(duì)重組體的一種正選擇 (見下圖 )。 克隆容量較小 ，一般在 10kb以內(nèi)，用于cDNA及小片段 DNA的克隆 。例如， 將 λ噬菌體在 EcoRI限制 修飾的宿主和 EcoRI限制 修飾缺陷型宿主之間反復(fù)地循環(huán)生長(zhǎng)，篩選到完全失去了EcoRI酶切位點(diǎn)的 λ噬菌體。 第二節(jié) λ噬菌體載體 一、 λ噬菌體載體的生物學(xué)特性 λ噬菌體的生活周期 λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能 cos位點(diǎn) (cohesiveend site)： λDNA環(huán)化時(shí)其粘性末端形成的雙鏈區(qū)段 . 左側(cè)區(qū)： A~J，約 20kb 右側(cè)區(qū)： N~R，約 12kb 中間區(qū)： J~N，約 18kb， 為非必須區(qū)段 cI 基因控制溶源過程，阻遏溶菌周期所有基因的表達(dá) λ噬菌體的 DNA復(fù)制 裂解周期的早期 ： θ型雙向復(fù)制 ，產(chǎn)生 環(huán)狀 DNA分子 ； 裂解周期的晚期 ： σ型滾環(huán)復(fù)制 ，產(chǎn)生 線性多聚體 DNA分子 。 親和層析法純化外源蛋白 。 表達(dá)載體 (根據(jù)受體細(xì)胞 ) 原核細(xì)胞表達(dá)載體 真核細(xì)胞表達(dá)載體 表達(dá)載體 (根據(jù)表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn) ) 分泌型表達(dá)載體 非分泌型表達(dá)載體 表達(dá)載體 (根據(jù)表達(dá)蛋白的組成 ) 融合型表達(dá)載體 非融合型表達(dá)載體 pBV221 rrnB 大腸桿菌表達(dá)載體的特征 (與克隆載體相比 )： ①?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子；如 Lac、 Trp、 Tac、 PL、 PR、 T7啟動(dòng)子 。 藍(lán)白斑篩選 (α篩選 )：是指利用外源基因插入載體上lacZ’5’端的多克隆位點(diǎn)而破壞 α互補(bǔ)、不能催化平板培養(yǎng)基中 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 (Xgal) 形成藍(lán)色產(chǎn)物、致使形成白色的重組菌落而篩選出重組子的方法。 pAT153 ② 引入帶單一 EcoRI的選擇標(biāo)記；如 pBR324(，具有大腸桿菌素 E1基因和免疫 imm基因 )、 pBR325(氯霉素抗性基因 )。 三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建 載體構(gòu)建的基本原則 ①根據(jù)基因操作的工作需要； ②符合理想載體的必備條件； ③ 選擇適合的親本質(zhì)粒提供載體元件 ； ④盡量簡(jiǎn)化構(gòu)建程序。 質(zhì)粒 接合型質(zhì)粒 (自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ):多屬于嚴(yán)緊型 非接合型質(zhì)粒 (不能自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ):多屬于松弛型 質(zhì)粒的遷移作用 是指非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒共存時(shí)可發(fā)生轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。 氯霉素、或鏈霉素等存在可使質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到幾千個(gè)。 質(zhì)粒的分子特性 雙鏈環(huán)形 DNA(絕大多數(shù) )、雙鏈線形DNA、 RNA(酵母的殺傷質(zhì)粒 )。 根據(jù) 受體細(xì)胞 不同載體分為 原核生物載體 (大腸桿菌載體 )、真核生物載體 (酵母載體、植物載體、動(dòng)物載體 )。第三章 基因工程載體 載體 (vector)是指基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的“運(yùn)載工具”，其本質(zhì)是 DNA復(fù)制子。 根據(jù) 功能和用途 不同載體可分為 克隆載體 、 表達(dá)載體 (標(biāo)簽載體、分泌載體 )、 測(cè)序載體 、 轉(zhuǎn)化載體 、 多功能載體 等。存在于 細(xì)菌 (最廣泛 )、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中。 大多數(shù)質(zhì)粒載體的復(fù)制起始區(qū)都來源于 pMB1質(zhì)粒 ，正常情況下在宿主細(xì)胞中可維持至少 15個(gè)拷貝。 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 是指質(zhì)粒從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的特性。 ③具有兩種以上的選擇標(biāo)記基因； ④缺失 mob基因或 nic位點(diǎn)； ⑤插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。 優(yōu)點(diǎn)： a、失去了 pBR322的HaeII的兩個(gè)片段，分子量更小，拷貝數(shù)高 pBR322的~3倍； b、失去了 nic位點(diǎn)，更安全。 α互補(bǔ) ：是指載體表達(dá)的 α肽與宿主菌中 F′因子的lacZ’△ M15基因的突變產(chǎn)物結(jié)合 (α肽與突變 β半乳糖苷酶的 C端片段結(jié)合 )形成具有酶活性的功能蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。 E c o S ac Kp n S m a B am X b a S al P s t S p h Hi nRI I I I HI I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9Hi n S p h P s t S al Xba B am S m a K p n S ac E c od I I I