【正文】 ⑤ 反應(yīng)系統(tǒng)組成 ⑥ 酶量、反應(yīng)體積、酶切時間 7. 限制酶的用途 ① DNA重組與構(gòu)建新基因組文庫 ② 組建 DNA物理圖譜 ③ DNA 分子雜交 ④ 制備 DNA放射性探針 ⑤ DNA序列分析 DNA連接酶 封閉 DNA鏈上缺口酶，借助能量催化 DNA鏈的 5′PO4與另一 DNA鏈的 3′OH生成磷酸二酯鍵。 粘尾質(zhì)粒 (cosmid) 1. 由 ?DNA的兩端粘性末端區(qū)域 (COS區(qū) )與質(zhì)粒構(gòu)建的環(huán)狀雙鏈 DNA 2. 特點 : ① 含質(zhì)粒的抗性標(biāo)記如 Amp?， Tet? ② 帶 COS區(qū)，可進(jìn)行體外包裝 ③ 一個或多個酶切位點 ④ 加入特異性啟動子利于雙向轉(zhuǎn)錄 ⑤ 分子量小，容量大 /篩選 AP平板 ⑥ 粘性 ?DNA質(zhì)粒接上能在真核細(xì)胞生活的元件則能在真核中轉(zhuǎn)染及篩選 大容量載體 ? 細(xì)菌人工染色體 (BACs): F質(zhì)粒，供體 DNA300kb,用于大基因組分析 ? P1人工染色體 (PACs)： 噬菌體 P1，需要體外包裝盒轉(zhuǎn)導(dǎo)，供體 DNA約 100kb,用于大基因組分析 ? 酵母人工染色體 (YACs)： 釀酒酵母著絲粒、端粒和自主復(fù)制序列，供體 DNA2022kb,用于大基因組分析和 YAC轉(zhuǎn)基因動物 質(zhì)粒的構(gòu)建策略 質(zhì)粒載體必需的三個部分 1. 復(fù)制區(qū)：含有復(fù)制起點； 2. 選擇標(biāo)記：抗性基因； 3. 克隆位點：便于外源 DNA的插入 質(zhì)粒的構(gòu)建策略 1. 縮短載體長度，擴充載體容納能力 2. 合理增加酶切位點數(shù)目，形成多克隆位點 3. 引入多用途輔助序列，提供質(zhì)粒新特 4. 設(shè)計具有特殊選擇標(biāo)記，最好是能夠賦予宿主易于檢測的表型 穿梭載體 (shuttle vector) 能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體 1. 具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點及選擇標(biāo)記基因 2. 有真核生物的自主復(fù)制序列 (ARS)以及選擇標(biāo)記性狀 3. 具有多克隆位點 4. 在細(xì)菌中用于擴增克隆的基因 5. 在真核生物中用于基因表達(dá)分析 穿梭載體 (shuttle vector) 表達(dá)載體 （ Expression vectors） 真核細(xì)胞載體 ? 哺乳動物細(xì)胞的病毒載體 1. 含有原核基因序列即：復(fù)制子和抗性基因 2. 含有哺乳動物細(xì)胞啟動子和增強元件使外源基因有效轉(zhuǎn)錄 3. 轉(zhuǎn)錄終止信號和 poly(A)信號 4. 含有可選擇的剪切信號 5. 含有一個以上的限制性酶切位點 真核細(xì)胞載體 ? 酵母載體 – 組成 — 遺傳標(biāo)記；調(diào)控序列（ ARS、環(huán)狀質(zhì)粒 DNA、啟動子）；由質(zhì)粒 DNA與酵母 DNA重組的穿梭質(zhì)粒 ? 桿狀病毒載體 — 昆蟲細(xì)胞多角病毒載體 – 具有蛋白修飾、加工和轉(zhuǎn)運體系 – 產(chǎn)物可溶性表達(dá) – 適于克隆大片外源 DNA – 不侵染脊椎動物 （二）重組 ? 體外重組技術(shù)的建立是建立在一系列可以在體外應(yīng)用的 DNA限制性內(nèi)切酶和 DNA連接酶，以及 PCR技術(shù)的推廣。 基因工程載體的基本條件 1. 能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖 2. 容易進(jìn)入宿主細(xì)胞 3. 有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點，容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制 4. 有容易被識別篩選的標(biāo)志 5. 容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來 基因工程載體分類 根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分 1. 質(zhì)粒型載體 — 環(huán)狀 dsDNA分子，自主復(fù)制 2. 病毒型載體 — 環(huán)狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 3. 混合型載體 — 具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性 根據(jù)載體功能劃分： 1. 克隆載體 — 質(zhì)粒、 λ噬菌體、粘性質(zhì)粒、 M13噬菌體 2. 表達(dá)載體 — 大腸桿菌表達(dá)載體、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體 常用載體 質(zhì)粒 (plasmid) — 獨立于細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀 DNA分子 質(zhì)粒的特點 1. 大多數(shù)質(zhì)粒 DNA是是環(huán)狀雙鏈的 DNA分子 2. 復(fù)制類型分為嚴(yán)緊型和松弛型 3. 有共價閉合環(huán)形、開環(huán)和線性三種構(gòu)型 4. 泳動速度： SCDNA LDNA OCDNA 5. 質(zhì)粒具有不相容性 6. 具有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象和遷移作用 pBR322質(zhì)粒 ? 分子量較小。 原理 在適當(dāng)緩沖液（ Mg2+）反應(yīng)體系中，根據(jù)堿基配對原理利用 DNA聚合酶催化和 dNTPs的參與下，引物依賴于 DNA模板特性指導(dǎo) DNA合成 基本步驟 1. 變性： 雙鏈 DNA解離成為單鏈 (90℃ 以上 ) 2. 退火 (復(fù)性 )： 引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合（ 50 ℃ 左右） 3. 延伸： DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的互補鏈 （ 70 ℃ 左右） PCR反應(yīng)五要素 ? 引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+ ? PCR反應(yīng)的特異性決定因素： 引物與模板 DNA特異正確的結(jié)合 堿基配對原則 Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性 靶基因的特異性與保守性 PCR的應(yīng)用 1. 研究 — 基因克隆； DNA測序；分析突變 2. 診斷 — 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測及診斷 3. 人類基因組工程 — 遺傳圖譜的構(gòu)建； DNA測序；表達(dá)圖譜 4. 法醫(yī) — 犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 5. 腫瘤 — 各種腫瘤檢測 6. 其他 …… 二、目的基因與表達(dá)載體的重組 ? 重組載體的構(gòu)建 ：對目的基因和載體 DNA進(jìn)行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復(fù)制能力的重組體。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)過程。第十章外源基因表達(dá)與基因工程藥物 第一節(jié) 概 述 ? 外源基因的表達(dá)：利用細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶系及其調(diào)控系統(tǒng)，將外源基因轉(zhuǎn)錄成肽鏈或加工成活性蛋白質(zhì)的過程。 基因工程概念 基因工程 (geic engineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類型的技術(shù) 基因工程的發(fā)展史 一、基因表達(dá)基本原理 ? 基因表達(dá) (gene expression)是指儲存遺傳信息的基因在各種調(diào)節(jié)機制下經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。 基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別 原核生物與真核生物肽鏈合成過程的主要差別 原核生物 真核生物 mRNA 一條 mRNA編碼幾種蛋白質(zhì)（多順反子） 一條 mRNA編碼一種蛋白質(zhì)（單順反子） 轉(zhuǎn)錄后很少加工 轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行首尾修飾及剪接 轉(zhuǎn)錄、翻譯和 mRNA的降解可同時發(fā)生 mRNA在核內(nèi)合成，加工后進(jìn)入胞液，再作為模板指導(dǎo)翻譯 核蛋白體 30S小亞基＋ 50S大亞基 ? 70S核蛋白體 40S小亞基＋ 60S大亞基 ? 80S核蛋白體 起始階段 起始氨基酰 t