基因工程的基本技術(shù)-資料下載頁
2025-09-11 21:09本頁面
【正文】 ?錨定 PCR ?反向 PCR ?套式 PCR ?不對稱 PCR ?長程 PCR ?鍋柄 PCR ?免疫 PCR ?RAPD ?定量 PCR ?原位 PCR F R ?（ 1） 特異 PCR 擴增所用的引物是特異的，擴出的產(chǎn)物也是特定的。 ? （ 2） RTPCR： 是一類以 mRNA為最初模板的基因的擴增。 A A A A A A A A A A 5`CAP T T T T T T T T T T T ?（ 3） 反向 PCR： 根據(jù)已知序列擴增兩側(cè)序列的方法。 已知序列 未知序列 未知序列 酶切 酶切 引物 2 引物 1 此 PCR操作過程： 酶切基因組 DNA 連接環(huán)化目的 DNA 用引物 1和引物 2組合擴增出側(cè)翼序列 ?（ 4） 定量 PCR 用途： 分析基因組中某個基因的拷貝數(shù)或分析基因的轉(zhuǎn)錄表達豐度。 實時熒光定量 PCR技術(shù)，是指在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 概念： 原理：通過 實時檢測 PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號， 來實現(xiàn)對 起始模板 進行定量及定性的分析。 初始模板量 X0的對數(shù)值與 C(T) 值之間呈線性關(guān)系： log X0= log(1+Ex) *Ct+ log N Threshold line C(t) value C(t) value +/ 閾值線 Ct值 Ct值 Ct 值的定義 在熒光定量 PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念 —— Ct值。 C代表 Cycle， t代表 threshold Ct值的含義是： 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號 開始由 本底進入指數(shù)增長階段時 到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示） PCR反應(yīng)的前 15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是 315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10倍，即： threshold = 10 180。 SDcycle 615 熒光域值（ threshold）的設(shè)定 研究表明，每個模板的 Ct值與該模板的 起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系 ， 起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小 。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代 Ct值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 Ct值與起始模板的關(guān)系 Threshold line C(t) value C(t) value +/ 閾值線 Ct值 Ct值 熒光信號如何產(chǎn)生？ SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan 熒光化學(xué)試劑 思考題 1 ? 假設(shè)通過基因槍轟擊技術(shù)，獲得一株具有 抗旱目的性狀 的轉(zhuǎn)基因水稻，但此轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)了 株高 比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账咀儼姆前行誀睢? ? 用 PCR相關(guān)技術(shù)回答下列問題： 如何確認此苗是轉(zhuǎn)基因苗？ 目的基因是否表達？表達量如何？ 株高變矮的可能原因分析。 提示： 轉(zhuǎn)基因時，目的基因是通過 TDNA的整合作用把TDNA的左右邊界和其中間的 目的基因 和 選擇標記基因 一起整合進受體細胞基因組中。 Tleft 標記基因 promoter T right 目的基因
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