基因工程的基本技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-09-11 21:09本頁(yè)面
【正文】 ?錨定 PCR ?反向 PCR ?套式 PCR ?不對(duì)稱 PCR ?長(zhǎng)程 PCR ?鍋柄 PCR ?免疫 PCR ?RAPD ?定量 PCR ?原位 PCR F R ?（ 1） 特異 PCR 擴(kuò)增所用的引物是特異的，擴(kuò)出的產(chǎn)物也是特定的。 ? （ 2） RTPCR： 是一類以 mRNA為最初模板的基因的擴(kuò)增。 A A A A A A A A A A 5`CAP T T T T T T T T T T T ?（ 3） 反向 PCR： 根據(jù)已知序列擴(kuò)增兩側(cè)序列的方法。 已知序列 未知序列 未知序列 酶切 酶切 引物 2 引物 1 此 PCR操作過(guò)程： 酶切基因組 DNA 連接環(huán)化目的 DNA 用引物 1和引物 2組合擴(kuò)增出側(cè)翼序列 ?（ 4） 定量 PCR 用途： 分析基因組中某個(gè)基因的拷貝數(shù)或分析基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)，是指在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 概念： 原理：通過(guò) 實(shí)時(shí)檢測(cè) PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)， 來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì) 起始模板 進(jìn)行定量及定性的分析。 初始模板量 X0的對(duì)數(shù)值與 C(T) 值之間呈線性關(guān)系： log X0= log(1+Ex) *Ct+ log N Threshold line C(t) value C(t) value +/ 閾值線 Ct值 Ct值 Ct 值的定義 在熒光定量 PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念 —— Ct值。 C代表 Cycle， t代表 threshold Ct值的含義是： 每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào) 開(kāi)始由 本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段時(shí) 到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示） PCR反應(yīng)的前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是 315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍，即： threshold = 10 180。 SDcycle 615 熒光域值（ threshold）的設(shè)定 研究表明，每個(gè)模板的 Ct值與該模板的 起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系 ， 起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小 。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代 Ct值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 Ct值與起始模板的關(guān)系 Threshold line C(t) value C(t) value +/ 閾值線 Ct值 Ct值 熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？ SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan 熒光化學(xué)試劑 思考題 1 ? 假設(shè)通過(guò)基因槍轟擊技術(shù)，獲得一株具有 抗旱目的性狀 的轉(zhuǎn)基因水稻，但此轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)了 株高 比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账咀儼姆前行誀睢? ? 用 PCR相關(guān)技術(shù)回答下列問(wèn)題： 如何確認(rèn)此苗是轉(zhuǎn)基因苗？ 目的基因是否表達(dá)？表達(dá)量如何？ 株高變矮的可能原因分析。 提示： 轉(zhuǎn)基因時(shí)，目的基因是通過(guò) TDNA的整合作用把TDNA的左右邊界和其中間的 目的基因 和 選擇標(biāo)記基因 一起整合進(jìn)受體細(xì)胞基因組中。 Tleft 標(biāo)記基因 promoter T right 目的基因
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