基因工程：第七章酵母基因工程(文件)
【正文】 PHO4溫度敏感型突變基因 pho4TS的編碼產(chǎn)物在 35℃ 時失活 酵母菌啟動子的可控性 a – a 型啟動子： 釀酒酵母有 a和 a兩種單倍體，分別由 MATa和 MATa兩個等位基因決定。 酵母菌表達系統(tǒng)的選擇 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒 pKD1已被廣泛用作重組異源 蛋白生產(chǎn)的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也 乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng) 能穩(wěn)定遺傳 40代以上。在此情況下，外源基因 具有經(jīng)濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。所不同的是， HARS質(zhì)粒 能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體 DNA上，甚至可以連續(xù)整合 100多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲 個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。 F 利用重組 酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 7 酵母基因工程 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的 雙鏈 DNA病毒 ，具有感染力的病毒 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu) 顆粒呈 球面 狀，直徑為 42 nm， 基因組僅為 kb。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白： S、 M、 L多肽 。 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組 HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化 重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達細胞總蛋白量的 1%2%。 。 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建 PARS2 Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 Bgl II pBSAG151 11 kb Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 his+的轉(zhuǎn)化子 重組分子 轉(zhuǎn)化 his的受體細胞 染色體 DNA 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 重組巴斯德畢赤酵母的性能 由于巴斯德畢赤酵母染色體 DNA上還擁有第二個乙醇氧化酶基因 AOX2， 所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長。雖然這種質(zhì)膜來源的 疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括 核心抗原 （ HBcAg ）、 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的 22 病毒 DNA聚合酶 、 微量病毒蛋白 。 F 利用重組 酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 7 酵母基因工程 由 乙型肝炎病毒 （ HBV） 感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重 的傳染病，每年約有 200萬 病人死亡，并有 3億 人成為 HBV攜帶者，其 中相當一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前已有 20余種 酵母菌表達系統(tǒng)的選擇 多型漢遜酵母也是一種 甲基營養(yǎng)菌 。 酵母菌表達系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種 甲基營養(yǎng)菌 ，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 長， 甲醇 可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達，因此生長 迅速、乙醇氧化酶基因 AOX1所屬強啟動子、表達的可誘導(dǎo)性是巴斯 德畢赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。 釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其 超糖基化 能力，往往使得 有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結(jié)合，而不能 大量分泌。 但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴重制約 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納 多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的 2533% 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如 Li+等）、 PEG、 熱休克 處理后，也可高效吸收質(zhì)粒 DNA， 而且具有下列特性： 吸收線型 DNA的能力明顯大于環(huán)狀 DNA， 兩者相差 8
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