基因工程第五章載體(文件)
【正文】 數(shù)可以達(dá)到 500－ 700個(gè) /個(gè)細(xì)胞。他們可以使得質(zhì)?？稍诓煌拗鏖g進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)移，研究在不同的細(xì)胞中的克隆、表達(dá)的調(diào)控功能。 ? 人工構(gòu)建的質(zhì)粒這個(gè)功能區(qū)已經(jīng)缺失，因此，它在細(xì)胞分裂中是隨機(jī)分配的，盡管出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞的幾率較低，但在一定的條件下，比如 ―― －細(xì)胞分裂較快或營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下，會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞。 解決辦法：功能性基因突變 Vector of ? phage Section two ?1974年， Davis發(fā)現(xiàn) ?噬菌體失去一部分 DNA后，仍然不失活，這一部分缺失 DNA的空間正好用來(lái)承載外源基因片斷，第一次證明了 ?噬菌體 DNA作為基因無(wú)性繁殖載體的可能性。 二、 噬菌體載體的構(gòu)建： 野生 ?噬菌體 DNA不適于用作基因克隆，改造集中于兩個(gè)方面： ? 消除多余的限制性?xún)?nèi)切酶切割位點(diǎn)： ?噬菌體 DNA作為載體來(lái)說(shuō)，突出的缺點(diǎn)是對(duì)大多數(shù)常用的核酸限制性?xún)?nèi)切酶都具有過(guò)多的限制性切點(diǎn)，而其中有的切點(diǎn)在基因組的必要區(qū)。因此，可以利用置換和缺失去除 ?噬菌體 DNA中一些非必要區(qū)，使他能拼接不同長(zhǎng)度的外源 DNA片斷。 裂解途徑：當(dāng) DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，形成環(huán)狀 DNA，進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，并合成頭 /尾。） 。溶源性在特殊的條件下可實(shí)現(xiàn)向裂解途徑的轉(zhuǎn)變。（ ?噬菌體裝配的要求是重組的 DNA分子要保證在 ――50kb 才能進(jìn)行裝配），所以對(duì)于大片斷不能采用 ?噬菌體載體。 ? 去除 ?噬菌體 DNA中的非必要區(qū)： ? 經(jīng)過(guò)測(cè)定， ?噬菌體 DNA中有一半?yún)⒓邮删w的生命活動(dòng)，即有 50％的基因?qū)κ删w的生長(zhǎng)和噬菌斑的形成是必須的。 一、 ?噬菌體的 DNA結(jié)構(gòu)特征： ??噬菌體的基因組是一條線(xiàn)性 DNA， DNA分子兩端各有一個(gè)由 12個(gè)核苷酸組成的互補(bǔ)的 5‘突出的黏性末端，所以，這種線(xiàn)性分子可以發(fā)生環(huán)化，形成閉合的環(huán)狀分子，這個(gè)位點(diǎn)成為 cos 位點(diǎn)，即黏性末端。 ? 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：質(zhì)粒分子帶有外源基因，外源基因有時(shí)會(huì)與宿主 DNA進(jìn)行同源重組，另外，一些誘變作用會(huì)產(chǎn)生外源 DNA的缺失、插入、重排，再有寄主染色體的轉(zhuǎn)座子也會(huì)使基因插入失活。 五、 質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性： 1. 分離的不穩(wěn)定性：是指在細(xì)胞分裂過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒 DNA，最終增值成為無(wú)質(zhì)粒的菌株，這種菌株由于沒(méi)有代謝壓力而具有較快的生長(zhǎng)速率，在體系中成為了優(yōu)勢(shì)菌群，最后導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失，這種現(xiàn)象叫質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。有利于檢測(cè) ?具有多克隆位點(diǎn)，便于片斷的插入。是在 pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)帶有多克隆位點(diǎn)的 LacZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的質(zhì)粒載體。當(dāng)我們把目的基因插入到抗性基因內(nèi)部，抗性基因就會(huì)失去活性，即不能進(jìn)行抗性蛋白物質(zhì)的合成，就為我們篩選提供一種標(biāo)記。 ?構(gòu)建含有強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)型質(zhì)粒載體，很多質(zhì)粒載體在多克隆位點(diǎn)的臨近位置上帶有外源啟動(dòng)子，插入的外源基因可以表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 2. 調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，引入多克隆位點(diǎn)： 新型載體都引入了一個(gè)人工合成的由多種常用限制性?xún)?nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)組成的序列，叫多克隆位點(diǎn)（ multiple cloning site, MCS ） 。 第一個(gè)經(jīng)改造的認(rèn)為較完善的質(zhì)粒載體是pBR313, 他是松弛型載體，引入了兩個(gè)標(biāo)記基因 抗四環(huán)素基因 Tecr和抗青霉素基因 Ampr, 他
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