基因工程課件2-2章(文件)
【正文】 段，并要求在其 3’末端或 5’端接上另外的 DNA片段（如終止子、啟動(dòng)子），顯然， pUC系列載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)是不太適宜，但選用pBS+中的多克隆位點(diǎn)區(qū)就能滿足要求。 R （細(xì)胞裂解） λ中部約 1/3的 DNA(b2)與 λ存活無(wú)關(guān)。 iii. 后期轉(zhuǎn)錄： cro蛋白可與 OL和 OR結(jié)合，阻止 RNA聚合酶與 PL和 PR結(jié)合，轉(zhuǎn)錄終止，此時(shí)已合成了足夠多的控制蛋白 Q，它對(duì) P39。 vi. 裂解：基因 R和 S產(chǎn)物形成，細(xì)菌細(xì)胞裂解，噬菌體顆粒釋放。 因此，頭部蛋白 gpE和 gpD以及包裝蛋白 gpA是 λ DNA形成噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據(jù)這一結(jié)論 頭 尾連接器g p B g p N u 3g p g r o E Lg p g r o E Sg p c. E g p N u 3g p E p x g p c g p A g p N u 1 E . co l iE . co l i IN F O r T H Fg p FII g p w g p D末端酶復(fù)合物I I ( F 1 可促進(jìn)該復(fù)合物形成）擴(kuò)張復(fù)合物Iλ DNAN u 1 左端 A B C N u 3 DE FI FIIWλ DNA的包裝 5） λDNA作載體的缺點(diǎn)和解決辦法 DNA的 78105%，即 Kb，天然 λ僅可插入 3 Kb外源 DNA片段 — 除去所有與 λ裂解無(wú)關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入 22 Kb。這類載體被限制酶切成左右臂。用于重組子檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因主要有 lacZ 基因。 λ載體 λ105 均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。 第二次切割是隨機(jī)的 ，無(wú)特異性 DNA序列。 pac位點(diǎn) : 一端含 4個(gè)六聚體 (5’ TGATCA/G 3’)，另一端則有三個(gè)，中間區(qū)域長(zhǎng) 90 bp， pacase切點(diǎn)位于靠近 90 bp區(qū)的中心序列。 克隆片段易于進(jìn)行次克隆 ii. 結(jié)構(gòu) 載體被二個(gè) loxP重組位點(diǎn)分隔為兩區(qū) — Ampr和 Kanr區(qū) Ampr區(qū)：來(lái)自 pBR322的 ori, pac位點(diǎn) (反時(shí)針包裝 ), 來(lái)自腺病毒的 11Kb填充片段 (插入到 ScaⅠ 位點(diǎn) ) Kanr 區(qū)： Kanr(Tn903)和 Tetr基因， P1質(zhì)粒復(fù)制子和分離系統(tǒng)， P1裂解復(fù)制子，其活性受 lac操縱基因啟動(dòng)子控制 oli pr om ot e rsac BP1 r e pr e ssorbi nd in g sit eT7 T3 Sal ISfiI N ot I Bam HI loxPA m pA d10 p AD10s acBII( kb )X baISca IpacloxPt e tlyt R e ppl asm id R e p kanr大腸桿菌 P1噬菌體載體 p Ad10 sacBⅡ s ac B B am HI+ 9 5 k b DN A fr a g m e n t p a c l o x Psa c BKa nDN A h e a d fu l + +Cr e R e c o m b i l a t i o n DNAA mpl i f i c a t i o np a c c l e a v a g ep r o t e i nlox PAm pAd 10 pA D 10s acB I I( 2 9. 3 k b )Xb aIS c a Ip a clox Plyt R e pp l as m id Re p k a nrrP1噬菌體載體構(gòu)建 基因組文庫(kù)的示意圖 pAd10 sacBⅡ ScaI+BamHI 長(zhǎng)臂 + 短臂 加入外源 DNA片段 重組 DNA分子 離體包裝 感染宿主細(xì)胞 SacB基因 :編碼一種 將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖的酶 ，當(dāng)含該基因的細(xì)胞培養(yǎng)在 2%以上蔗糖培養(yǎng)基中時(shí) ,果聚糖積累在細(xì)胞周質(zhì)空間內(nèi)，導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞死亡 SacB基因被克隆到原 Tetr 基因的 BamHI SalI間 ,在其上游加上 ,克隆位點(diǎn) BamHI位于這兩個(gè) DNA片段間 ,外源DNA片段插入時(shí)可進(jìn)行 顯性篩選重組子 為了 使 sacB基因自發(fā)突變減小到最小限度 ,sacB基因上游還有一個(gè) P1 C1阻遏物結(jié)合位點(diǎn) 與其啟動(dòng)子重疊。 mcr和 mrr: 抑制富含 GpMeC或 ApMeC插入片段的選擇性丟失 3. M13和 fd載體 1) 結(jié)構(gòu)特征 — 環(huán)狀 ssDNA，病毒顆粒呈絲狀 2) 復(fù)制過(guò)程 ： ss（ +） RF(01 min) RF RF(020 min) RF ss(+)(20 min→ ∞)DNA包裝無(wú)嚴(yán)格限制
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