《基因工程final》ppt課件(文件)
【正文】 A的提取分離程序 雙鏈 DNA加熱至 9095℃ 變性解旋成為單鏈 DNA，成為互補鏈聚合反應的模版 降溫至 3760 ℃ 與模版復性結合 升溫至 7075 ℃ ， DNA聚合酶催化引物按 5‘ 3’延伸，合成模版 DNA鏈的互補鏈 N個循環(huán)，達到 2n的拷貝數(shù) 利用 PCR擴增目的基因 PCR原理 利用 PCR擴增目的基因 引物 1 目的基因 已知序列 已知序列 引物 2 PCR擴增 含有目的基因的 DNA片段 必須知道待擴增目的基因 DNA片段的核苷酸序列 待擴增片段兩端長約 20bp的序列已知， 允許擴增的 DNA片段長度一般在 1kb以內(nèi) 擴增未知序列或長達幾千 bp的大基因，需要特殊類型的 PCR策略 RTPCR 、免疫 PCR 、巢式 PCR 、實時熒光 PCR、原位 PCR技術等 30幾種 PCR之歌 從前你要擴增 DNA， 總有培養(yǎng)大批細胞的重任要你背。 3. 根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算 出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。 將目的基因?qū)胧荏w細胞 將受體細胞進行擴增 將重組 DNA導入受體細胞并擴增 將重組 DNA導入受體細胞并擴增 將目的基因?qū)胧荏w細胞 將受體細胞進行擴增 轉(zhuǎn)化 ： 外源裸露 DNA進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。 受體細胞是否具 運載體特有的 “ 標記基因 ” 所控制的性狀 檢測依據(jù) 根據(jù)載體抗性基因和相應的藥物篩選轉(zhuǎn)化子 卡那霉素抗性基因（ cat或 cmr） 卡那霉素 四環(huán)素抗性基因（ knr或 kanr） 四環(huán)素 根據(jù)報告基因篩選轉(zhuǎn)化子 螢火蟲熒光素酶報告基因（ luc） 綠色熒光蛋白基因（ gfp） 根據(jù)噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子 重組子的鑒定 根據(jù)重組 DNA分子特征鑒定 ? 根據(jù)重組 DNA分子大小 ? 酶切圖譜 ? PCR擴增片段鑒定 ? DNA雜交法鑒定： Southern 雜交，斑點印跡雜交， 菌落（噬菌體）原位雜交 ? 應用 DNA芯片鑒定 ? 根據(jù) DNA核苷酸序列鑒定 DNA = 瓊脂糖電泳 = 印跡轉(zhuǎn)移 = 預雜交 = 雜交（變性探針） = 洗膜 = 放射自顯影或顯色 重組子的鑒定 根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（ mRNA）鑒定 Northern 雜交：用 DNA探針檢測 RNA分子 mRNA提取 = 甲醛變性電泳 = 印跡轉(zhuǎn)移 = 預雜交 = 雜交（變性探針） = 洗膜 = 放射自顯影或化學發(fā)光 根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、酶、多肽）鑒定 重組子的鑒定 凝膠電泳檢測 生化反應檢測 免疫學檢測 生物學活性檢測 ? 酶聯(lián)免疫吸附（ ELISA） ? Westhern印跡法 ? 免疫沉淀測定 目的基因 基因載體 重組體 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 總體技術路線 基因工程的應用 基因工程藥物 : 干擾素、生長因子、腫瘤壞死因子、促紅細胞生成素 新型疫苗 : 口服轉(zhuǎn)基因疫苗 DNA治療 : 腫瘤、血友病、地中海貧血、艾滋病、心血管疾病 轉(zhuǎn)基因植物 : 抗病、抗蟲、抗旱、改變花色、表達藥用蛋白 轉(zhuǎn)基因動物 : 生長、肉質(zhì)、抗病、生物反應器 第一次測驗題目 ： 簡述基因工程研究的基本技術路線 。 化合物誘導轉(zhuǎn)化 ：感受態(tài)細胞 電穿孔轉(zhuǎn)化 ：高電壓脈沖產(chǎn)生瞬間通道 超聲波處理轉(zhuǎn)化 ：擊穿細胞膜形成膜通道 脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化 ：磷質(zhì)雙層包裹 DNA 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 ：動物細胞捕獲 DNA磷酸鈣沉淀物 常用轉(zhuǎn)化法 篩選含有目的基因的受體細胞 前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因。 DNA合成儀 PCR擴增儀 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
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