【正文】 子宮中 。已有許多實驗證明 ， 一些具有 DNA基因組或其生活史中出現(xiàn)有 DNA階段的真核生物的病毒 ， 經(jīng)改建后 ， 都可以發(fā)展成為動物基因工程的載體 。 因此 ， 任何插入在動物病毒基因組內(nèi)的外源基因 ， 在病毒感染之后的很短時間內(nèi) ， 其劑量就會得到顯著的增加 ， 并實現(xiàn)有效的表達(dá) 。 ⑤ 病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識別細(xì)胞接受器(acceptor)， 因此外殼蛋白質(zhì)可作為感染劑(infectious agents) 能夠?qū)⑼庠椿蚋咝У貙?dǎo)入寄主細(xì)胞 。 SV40病毒的基因組是一種環(huán)形雙鏈的 DNA，其大小僅有 5243bp，很適于基因操作。 如 ， 猿猴細(xì)胞 。 (2) SV40病毒的基礎(chǔ)分子生物學(xué) SV40病毒是一種小型的 20面體的蛋白質(zhì)顆粒 ，由三種病毒外殼蛋白質(zhì) VPl、 VP2和 VP3構(gòu)成 ，中間包裝著一條環(huán)形的病毒基因組 DNA。 如同大多數(shù)的病毒一樣 ， SV40病毒基因組表達(dá)的時間順序是相當(dāng)嚴(yán)格的 。早期轉(zhuǎn)錄本的合成，就是由位于這個區(qū)段內(nèi)的一對 72核苷酸序列串聯(lián)而成的強(qiáng)化因子序列激活的。晚期轉(zhuǎn)錄本按照其特定的沉降系數(shù)，可區(qū)分為 16S、 18S和 19S三種 mRNA，它們分別編碼 VPl、 VP3和 VP2病毒蛋白質(zhì)。 因此 ， 野生型的 SV40病毒必須經(jīng)過改造之后 ， 才能發(fā)展成為基因克隆的有用載體 。 按照同樣的道理 ， 也可以構(gòu)建出早期區(qū)段取代載體 (early region replacement vector)。 利用這種能力 ， 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一類特殊的病毒載體 。多瘤病毒的結(jié)構(gòu)同 SV40病毒十分接近，但它的受體細(xì)胞是小鼠細(xì)胞而非猿猴細(xì)胞。 這里必須指出的是 ， 在這種病毒 — 質(zhì)粒載體中 ，質(zhì)粒 DNA 部 分 不 應(yīng) 含 有 所 謂 的 “ 毒 性 序列 ” (poison sequence)。 因此適合于用來構(gòu)建哺乳動物的病毒 — 質(zhì)粒載體 ?？梢杂脕砀咚降乇磉_(dá)外源蛋白質(zhì)。 迄今已經(jīng)在鳥類及哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)了許多種反轉(zhuǎn)錄病毒。從感染細(xì)胞中分離出來的反轉(zhuǎn)錄病毒的 DNA，是一種有用的動物細(xì)胞的基因載體。 反轉(zhuǎn)錄病毒作為動物基因克隆載體的優(yōu)點： 第一 ， 在大多數(shù)情況下 ， 反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因(oncogene， onc)都能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄 。由于病毒的寄主范圍實質(zhì)上是由其蛋白質(zhì)外殼決定的，因此使用這種假型病毒便有可能將某些病毒基因組導(dǎo)入正常無法感染的細(xì)胞，從而進(jìn)一步擴(kuò)大寄主范圍。 因此 ， 有可能利用反轉(zhuǎn)錄病毒作載體 ， 改變動物細(xì)胞的基因型 ， 并可遺傳到子代細(xì)胞 。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn) ， 基因工程學(xué)家便設(shè)想構(gòu)建能夠表達(dá)多種病原體抗原的重組痘苗病毒 ， 作為預(yù)防這些病原體感染的活疫苗 。 但是只有完全分化的扁平的上皮細(xì)胞 (epithelial cell)， 才能產(chǎn)生感染性的乳頭瘤病毒 ， 迄今為止還沒有辦法在培養(yǎng)的細(xì)胞中增殖這種病毒 。 從這點考慮 ， 乳頭瘤病毒載體比上面所討論的整合性載體具有突出的優(yōu)點 ， 因而在近年很受人們的關(guān)注 。 其次 ， 在腺病毒感染周期中 ，寄主蛋白質(zhì)合成被關(guān)閉掉了 ， 因此能最大限度地合成病毒編碼的蛋白質(zhì) ， 這種特性為克隆基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的檢測與純化提供了很大的方便 。根據(jù)此類再生片段的感染性，便可篩選出由這些片段重新連接形成的完整的基因組。 例如已經(jīng)證明 ， Ad2左邊末端片段在體外克隆和突變之后 ， 再連接到缺失了左邊末端片段的 Ad5基因組 DNA上 ， 這樣的重組體分子感染了人細(xì)胞之后 ， 會正確地再生出左邊末端片段 ， 從而恢復(fù)了腺病毒 DNA的末端重復(fù)結(jié)構(gòu) ， 而且子代病毒 DNA也是具有感染性的 。 因為腺病毒并不能夠感染猿猴細(xì)胞 ， 而含有SV40病毒 T抗原的重組分子卻可以在這種細(xì)胞中表達(dá) 。 。 在體外已經(jīng)構(gòu)建成的這類腺病毒 SV40重組載體中 ， T抗原基因的表達(dá)是在腺病毒主要的晚期啟動子控制下進(jìn)行的 。 同樣的道理 ， 如果通過這種辦法將外源基因插入在El早期基因區(qū) ， 也就必須提供輔助功能才能完成感染周期 。 ※ 由于在腺病毒的兩段反向末端重復(fù)序列中 ，只要有一段是完整的 ， 另一段的缺失也就能夠得到恢復(fù) 。 腺病毒載體的構(gòu)建 ※ 在腺病毒載體的構(gòu)建過程中，失去某種限制位點的腺病毒 DNA是在體外選擇的。 3． 腺病毒載體 ※ 腺病毒具有很大的發(fā)展為真核基因的表達(dá)體系潛力 。 然而 有幾種乳頭瘤病毒的 DNA能夠轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的細(xì)胞 ， 而且在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi) ， 病毒的基因組保持游離的多拷貝的狀態(tài) ， 每個分離后的細(xì)胞可達(dá) 50一 200份 。 已有研究表明 ， 人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus， HPV)能夠誘發(fā)人宮頸癌 (human cervical carcinoma)。 當(dāng)人們接種了痘苗病毒之后 ， 便可獲得對天花的高度免疫性 。 有些反轉(zhuǎn)錄病毒 ， 例如鼠乳腺腫瘤病毒 ， 其啟動子的活性功能的開啟或關(guān)閉可以通過實驗手段予以控制 。其中有的還能夠在人體細(xì)胞中生長。并非所有本類群的病毒都是致癌的。 其中研究得最為詳盡的則要數(shù)勞斯肉瘤病毒(Rous sara virus， RSV)。它的基因組含有 2條相同的正鏈 RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。根據(jù)這種原理 ， 許多實驗室都把只含有 SV40 復(fù)制起點的 DNA片段 ， 即所謂的微型病毒復(fù)制子 (miniviral replicon)， 插入在大腸桿菌的質(zhì)粒載體上 ，構(gòu)成了一種新型的病毒 — 質(zhì)粒載體 ， 稱為 微型病毒復(fù)制子 — 質(zhì)粒載體 。 由于某種未知因素的影響 ， 這段序列的存在 ， 會使哺乳動物細(xì)胞中的任何 DNA復(fù)制失效 。經(jīng)過 4～ 6天，每個細(xì)胞中累積的拷貝數(shù)高達(dá) 50,000～ 400,000份，從而加強(qiáng)了外源基因的表達(dá)能力。 它們既可在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制 ， 也能在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制 。 通過由一種輔助病毒提供 T抗原 ， 被這種取代載體感染的受體細(xì)胞 ，便會出現(xiàn)正常的裂解周期 。 因此 ，可以通過取代晚期區(qū)段的途徑構(gòu)建 SV40病毒載體 。 2． 取代型重組病毒載體 野生型的 SV40病毒顆粒的包裝范圍相當(dāng)嚴(yán)格 ，超過其基因組大小 ()的重組 DNA就不能夠被包裝為成熟的病毒顆粒 。 通過不同的剪輯途徑 ，早期初級轉(zhuǎn)錄本加工成 2種不同的早期 mRNA；而晚期的初級轉(zhuǎn)錄本加工成 3 種不同的晚期mRNA。 圍繞在 SV40 DNA復(fù)制起點周圍約 400bp的DNA區(qū)段，是十分引人注意的。 這些組蛋白使病毒 DNA分子緊縮成真核染色質(zhì)所特有的念珠狀核小體 ， 這種結(jié)構(gòu)特稱為 微型染色體 (mini— chromosome)。 ③ 半受體細(xì)胞： SV40接觸細(xì)胞后 ， 只有 1％ 一 2％ 會產(chǎn)生出感染性的病毒 ， 大多數(shù)整合到基因組上 ， 從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化 。 (1) SV40病毒的生命周期 根據(jù) SV40感染作用的不同效應(yīng) ， 可將其寄主細(xì)胞分成三種不同的類型 。 1． SV40病毒的基本生物學(xué)特性 猿猴空泡病毒 40(Simian vacuolating virus 40，SV40)載體的發(fā)展速度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它動物病毒載體。 這些病毒經(jīng)過基因操作改造之后 ， 可以發(fā)展成為能夠在細(xì)胞內(nèi)長時間保持高拷貝外源基因的復(fù)制型質(zhì)粒載體 。 這些啟動子不但可以啟動動物基因工程中常用的一些標(biāo)記基因的表達(dá) ， 而且還能夠啟