《基因工程上》ppt課件(文件)
【正文】 容納的外源 DNA也較大。 （ 2）含易于檢測(cè)是否有外源 DNA插入的標(biāo)記基因 LacZα ，可利用 ?互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 ? 常用的為人工構(gòu)建的 λ 噬菌體載體 。 將所有的重組 DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增 ，得到分子克隆的混合體 ， 這樣一個(gè)混合體稱為基因組文庫(kù) (genomic library)。 在細(xì)胞中，表達(dá)基因一般僅占基因總數(shù)的 15%左右，所以從 mRNA出發(fā)分離目的基因 極大地縮小了搜索目的基因的范圍。 (四 )人工合成基因 人工合成基因需先知道目的基因的結(jié)構(gòu)與核苷酸序列及其他相關(guān)的基因信息 。 二、目的基因與載體的連接 (一 ) 粘性末端連接 (二 ) 平頭末端連接 (三 ) 人工接頭法 (四 ) 同源多聚尾連接法 粘端連接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4DNA連接酶 平端連接 AGCT TCGA AluⅠ DNA連接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA (三 )人工接頭法 人工接頭主要用于在 DNA分子的平頭末端上添加新的內(nèi)切酶位點(diǎn) ， 產(chǎn)生粘性末端 ，以提高連接效率 。 進(jìn)行無(wú)性繁殖時(shí)所采用的受體細(xì)胞又稱宿主細(xì)胞，在選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后，經(jīng)特殊方法處理，使之成為感受態(tài)細(xì)胞 (petent cell)，具備接受外源 DNA能力。 根據(jù)重組載體和宿主細(xì)胞的不同，運(yùn)用不同的名詞描述進(jìn)入過(guò)程： 四、目的基因的篩選和鑒定 將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞以后，首要任務(wù)是篩選含有目的基因的 陽(yáng)性克隆 并加以擴(kuò)增。 例如質(zhì)粒 pBR322含有 Ampr 、和 tetr兩個(gè)抗藥基因，若將目的序列插入 tetr基因序列中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，讓細(xì)菌放在含氨芐青霉素或四環(huán)素培養(yǎng)基中，凡未接受質(zhì)粒 DNA的細(xì)胞都不能生長(zhǎng)；凡在含氨芐青霉素和四環(huán)素中都能生長(zhǎng)的細(xì)菌是含有質(zhì)粒 pBR322的，但其 pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長(zhǎng)、而在四環(huán)素中不能生長(zhǎng)的細(xì)菌就很可能是含有目的序列的重組質(zhì)粒。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具 β — 半乳糖苷酶活性； 只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性， 該作用稱之為 α 互補(bǔ)作用 。 lacZ（ lacZα ）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無(wú)外源 DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá) β — 半乳糖苷酶的 α 肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼 α 肽）表達(dá)的 lacZ基因產(chǎn)物（ β 鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的 β —半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導(dǎo)劑 IPTG(異丙基 β硫代半乳糖苷 )的存在下 (誘導(dǎo)物 IPTG可誘導(dǎo) α 片段的合成，有活性的 β — 半乳糖苷酶能水解底物 Xgal，產(chǎn)生藍(lán)色化合物。核酸探針可以用放射性核素標(biāo)記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團(tuán)可用放射性自顯影（ auroradiography）法指示出來(lái)，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標(biāo)記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來(lái)。 這是在上述篩選后的進(jìn)一步分析。已知序列的核酸克隆要經(jīng)序列測(cè)定確證所獲得的克隆準(zhǔn)確無(wú)誤；未知序列的核酸克隆要測(cè)定序列才能確知其結(jié)構(gòu)、推測(cè)其功能，用進(jìn)一步的研究。 要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越，常用的酵母、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和哺乳類細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。只需 300～ 600只這樣的母豬就能滿足全世界對(duì)這種蛋白的需求。 轉(zhuǎn)基因食品 “分子生物學(xué)研究方法 ” 思考題： 常用的核酸的凝膠電泳是哪兩種？它們分辨 DNA片段的范圍有何不同？ 核酸的分子雜交的概念？ Southern 印跡法、 Northern 印跡法和 Western 印跡法的檢測(cè)對(duì)象分別是什么？ PCR定義？簡(jiǎn)述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基本原理？ 核酸 測(cè)序的常用方法有哪些？ 列出用于基因克隆的主要工具酶。 cDNA文庫(kù)的概念。 載體的概念。斯卡騰博士說(shuō)，這些克隆猴將用于人類糖尿病和帕金森氏病的研究。 ②在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件， 包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加 polyA信號(hào)序列、 mRNA剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)等。 外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 重組子 目的基因的 mRNA 表達(dá)蛋白質(zhì) 大腸桿菌（ ） 受體細(xì)胞 人類對(duì)大腸桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有二十多年的經(jīng)驗(yàn)積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的 80%。這就可以進(jìn)一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。如果已知目的序列的長(zhǎng)度和兩端的序列，則可以設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞所得的 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長(zhǎng)度的 PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細(xì)胞就可能含有目的的序列。 P LacZα LacZβ 轉(zhuǎn)錄 翻譯 α β LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物 利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的 DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列
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