【正文】 ，識別序列可以以 5‘ →3‘走向的單鏈DNA表示 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 具有特定的酶切位點 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 切割類型 ? 兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列 ? 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 切割頻率 P=（ 1/4） n n： 酶識別的堿基數(shù)。 ? 由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結(jié)合形成的位點，特稱之為“雜種位點”（ hybrid site）。 ? DNA的純度 提高核酸內(nèi)切酶對低純度 DNA的反應(yīng)效率，一般采用 3種方法： ①增加核酸內(nèi)切限制酶的用量 ②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積 ③延長酶催化反應(yīng)的保溫時間 ? DNA的甲基化程度 識別序列中 特定核苷酸的甲基化作用會強(qiáng)烈地影響酶的活性。 ? 1974年以后，科學(xué)界正式肯定了這一發(fā)現(xiàn)，并把這種酶叫作 DNA連接酶。 ? 如果是兩個或兩個以上不同的雙鏈 DNA片段末端連接，則產(chǎn)生重組 DNA分子。 ? 與連桿的重要區(qū)別是合成的 銜接頭的一端或兩端已具有一種或兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端 。 ⑦ 也用于 PCR反應(yīng)進(jìn)行體外擴(kuò)增基因 DNA序列 ， 但已經(jīng)被 Taq DNA聚合酶代替 。 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶的主要用途 ① 以 mRNA為模板合成 cDNA ， 是反轉(zhuǎn)錄酶的最主要的用途 ② 利用其 5?→3‘外切酶活性 ， 標(biāo)記帶 5?突出末端的 DNA片段 ③ 當(dāng)其他酶用于雙脫氧鏈終止法測序效果不理想時 ， 則可試用反轉(zhuǎn)錄酶 5’ AAAAA3’ 引物 5’ AAAAA 3’ TTTTT 5’ 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 全長 cDNA 提前終止反應(yīng) 第四節(jié) DNA修飾酶 一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ※ 簡稱末端轉(zhuǎn)移酶 ，能夠催化 5′脫氧核苷三磷酸進(jìn)行 5′→ 3′方向的聚合作用 ※ 不需要模板存在就可以催化 DNA分子發(fā)生聚合作用 第四節(jié) DNA修飾酶 二、堿性磷酸酯酶 ※ 細(xì)菌堿性磷酸酶（ bacterial alkaline phosphatase，簡稱 BAP）；小牛腸堿性磷酸酶（ calf intestinal alkaline phosphatase，簡稱 CIP） ※ 使 DNA（或 RNA）片段的 5′P末端轉(zhuǎn)換成5′OH末端 第四節(jié) DNA修飾酶 三、 T4多聚核苷酸激酶 ※ 從 T4噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞中分離出來 ※ 催化 γ磷酸從 ATP分子轉(zhuǎn)移給 DNA或 RNA分子的 5′OH末端 第四節(jié) DNA修飾酶 四、甲基化酶 ※ 可使細(xì)菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成 5‘甲基胞嘧啶和 6‘甲基腺嘌呤 ※ 5‘甲基胞嘧啶（ Dcm 甲基化酶識別 CCAGG 或 CCTGG 序列，在 第二個胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基） ※ 6‘甲基腺嘌呤（ Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基） 第四節(jié) DNA修飾酶 四、甲基化酶 ※ 常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同 ? 如： M. EcoR I GAmATTCC EcoRI G AATTC 不同 ? M． Hpa I CmCGG Hpa I C CGG 相同 對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶 ? 限制酶 識別序列 * 甲基化酶 ? AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm ? BclⅠ TGATCA dam ? ClaⅠ GATCGAT dam ? EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm ? HphⅠ GGTGATC dam ? MboⅠ GATC dam ? NruⅠ GATCGCGA dam ? Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm ? SauFⅠ CC(A/T)GG dcm ? StuⅠ AGGCCTGG dcm ? TagⅠ GATCGA dam ? XbaⅠ TCTAGATC dam *下橫線字母表示限制酶識別序列 , 綠色字母表示 dam甲基化酶識別序列 ,紅色字母表示 dcm甲基化酶識別序列 ? 甲基化對限制酶切的影響 ① 修飾酶切位點 ② 產(chǎn)生新的酶切位點 ③ 對基因組作圖的影響 （ 使 DNA分子部分甲基化 ， 然后再用限制酶切 ） 第三章 基因克隆的載體 教學(xué)目的和要求： ? 了解各種載體一般生物學(xué)特性 ? 學(xué)會看懂質(zhì)粒圖，掌握各種載體的用途 ? 把一個有用的目的的 DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫 載體 ? 能與目的基因結(jié)合，且有完整的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的 DNA大分子稱之為 載體（ vector） ? 多數(shù)載體是 DNA分子，但某些 RNA分子也能用做載體。 rep基因 ： 指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 ② 不親和性 不親和性是指在沒有選擇壓力的情況下 ， 兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒 ，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存 的現(xiàn)象 。 不含 tra基因的質(zhì)粒稱為 非接合質(zhì)粒 。 隱蔽質(zhì)粒： 藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略 ? 能進(jìn)行有效復(fù)制 ——復(fù)制起始位點（最好是多拷貝） ? 克隆位點 ——組裝 MCS連桿 ? 選擇標(biāo)記基因 ——抗性基因， Lac Z‘基因 ? 分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），＞ 15kb，轉(zhuǎn)化率 ↓↓ ? 組裝各種“元件”，如啟動子、終止子等 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建 ※ 構(gòu)建過程： 嚴(yán)密的實驗設(shè)計 →構(gòu)建（切割、修飾和連接重組） 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒克隆載體構(gòu)建 ※ 構(gòu)建原則 ： ? 選用合適的出發(fā)質(zhì)粒 ? 正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件 ? 組裝合適的選擇標(biāo)記基因 ? 選用合適的啟動子 ? 構(gòu)建過程力求簡單 質(zhì)粒 DNA的分離與純化 ? 常用的有：氯化銫－溴化乙錠密度梯度離心法、堿變性法、煮沸裂解法、羥基磷灰石柱層析法、酸酚法、兩相法等 氯化銫密度梯度離心法 ? 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉 （ SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解； ? 將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中 ， EB會嵌入到 DNA鏈的堿基中去； ? 在 EB達(dá)到飽和時 ， 進(jìn)行氯化銫密度梯度離心 。（ 65度水浴一段時間會加強(qiáng)染色體 DNA的變性作用。 第三節(jié) 病毒（噬菌體）載體 ※ 分類 （根據(jù)病毒與宿主關(guān)系）： 溫和性病毒： 溶原性增殖 → 構(gòu)建病毒載體 烈性病毒： 溶菌性增殖 → 改造后構(gòu)建病毒載體 ※ 噬菌體的生命周期分為 溶菌周期 和溶源周期 ，只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫 烈性噬菌體 。 λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 技術(shù)路線 ： ① 用限制性酶切去非必需區(qū) ， 抹去多余識別位點 λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 技術(shù)路線 ： ② 在 λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 最常用的篩選標(biāo)記： Lac Z基因 λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 技術(shù)路線 ： ③ 建立重組 λDNA分子體外包裝系統(tǒng) D（ D基因缺失噬菌體 ） ＋ E（ E基因缺失噬菌體 ） ＝ λ 噬菌體 λ噬菌體 （四） λ噬菌體載體的類型 ①插入型 （ Insertion vectors） ? 一種只具有一個可供外源 DNA插入的克隆位點的派生載體。 ? 柯斯質(zhì)粒pHC79 系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體 λ的cos位點的一段 DNA構(gòu)成全長 Cosmid載體的特點 ①具有 λ噬菌體的特性 ②具有質(zhì)粒載體的特性 ③高容量的克隆能力 采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足 ① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質(zhì)粒載體連在一起。 ? 有酵母的自主復(fù)制序列、著絲點、四膜蟲的端粒以及酵母選擇性標(biāo)記組成的酵母線性克隆載體。 ? 拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，比 YAC易分離。 哺乳動物人工染色