基因工程第五章載體-預(yù)覽頁
【正文】 多，每個細胞中由 10－ 200個不等。 5. 質(zhì)粒的提取與純化： ?原理：理想的狀態(tài)是細胞裂解后，大部分 DNA釋放到裂解液中，根據(jù)共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA在 時，線性 DNA會完全變性，而共價閉合環(huán)狀的 DNA只是氫鍵斷裂，酸中和后，共價閉合環(huán)狀的 DNA迅速準(zhǔn)確地復(fù)性，而線性 DNA聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白和 RNA一道離心沉淀，上清液中的質(zhì)粒 DNA用乙醇沉淀出來。（ 4）將細菌沉淀重懸于 100μl用冰預(yù)冷的溶液 I中（溶液 Ⅰ ： 50mmol／ L 葡萄糖， 25mmol／ L Tris ?第二步：加 200μl新配制的溶液 Ⅱ （現(xiàn)用現(xiàn)配）（ ／ L NaOH ， 1％ SDS）．蓋緊管口，快速顛 倒離心管，以混合內(nèi)容物冰浴 5min。 ?第三步：加 150μl用冰預(yù)冷的溶液 Ⅲ （ 5mol／ L乙酸鉀 60ml，冰乙酸 ， pH為 ）。 加等體積氯仿，振蕩混勻， 4℃ 12022rpm離心 10分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。棄上清，加入 70%冷乙醇洗沉淀 12次真空干燥 DNA沉淀后，將其溶于 TE溶液中。 pBR322 拷貝數(shù)大于 25個 產(chǎn)量 ColE1 15個 ug/ml 基因克隆盡量選擇松弛型質(zhì)粒，如果是嚴(yán)緊型要進行質(zhì)粒復(fù)制子改造。 質(zhì)粒的構(gòu)建有三個方面： 1. 引入易于檢測的選擇性標(biāo)記，去掉質(zhì)粒的非必需序列： ? 最早使用的質(zhì)粒載體只有一個選擇性標(biāo)記：抗性基因（一個標(biāo)記有局限性：無法知道外源基因是不是轉(zhuǎn)化進入宿主細胞，因為空載體也可使菌株產(chǎn)生抗性）。 必要和非必要區(qū)各自獨立，所以我們可以把非必要區(qū)去除，只留下必要區(qū)。 啟動子的可控性啟動子的可控性PP乳糖啟動子 Pl a c的可控性：乳糖啟動子 P l a c 的可控性：OOPP OO高效轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白阻遏蛋白誘導(dǎo)誘導(dǎo)乳糖 異丙基 ? D 硫代半乳糖苷（ I P T G ）乳糖 異丙基 ? D 硫代半乳糖苷（ I P T G ）野生型的 Pla c與其控制區(qū) Olac野生型的 Pla c與其控制區(qū) Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基存在時，整個操縱子處于基底水平表達；誘導(dǎo)物可以使底水平表達；誘導(dǎo)物可以使啟動子 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅啟動子 P lac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高提高?構(gòu)建可對重組克隆進行選擇的質(zhì)粒載體，這種質(zhì)粒載體具有直接選擇標(biāo)記并可賦予寄主細胞相應(yīng)的表型（熒光蛋白）。 ? 有兩種抗生素抗性基因，可作為轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記。 pUC質(zhì)粒載體： ?pUC質(zhì)粒載體：是由美國加利福尼亞大學(xué)的專家構(gòu)建的。 ?適合組織化學(xué)法檢測重組子。 ?目前像大腸桿菌－枯草芽孢的穿梭質(zhì)粒，大腸－釀酒酵母，大腸－動物等。 解決辦法：施加選擇性壓力（抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)）。 ??噬菌體載體和外源基因重組后，可以隨寄主細胞一道復(fù)制和增值，在溶源周期，可整合到宿主染色體上，這是 ?噬菌體載體作為基因工程載體的以發(fā)展重要特征。所以我們要對它進行改造，改造可通過點突變，序列置換及缺失。 ? ?噬菌體載體有一個系列，分別可容納 9－ 22kb的片斷。然后切割，包裝、釋放
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