基因工程-7章pcr技術(shù)及其應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配 ,反應(yīng)特異性下降。 2022/9/20 28 （ 4）模板 單、雙鏈 DNA均可。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中 dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence 2022/9/20 21 每完成一個(gè)循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 ㈡ PCR的基本原理 ? 類(lèi)似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制。 ? 但由于測(cè)序和引物合成的困難 ，以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能 ， 所以 ，Khorana設(shè)想被人們遺忘了 …… 2022/9/20 10 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? DNA的復(fù)制 ? DNA變性與復(fù)性 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ? 1985 年 ， 美國(guó) PECetus 公 司 的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 。PCR反應(yīng)的模板 ? 重組質(zhì)粒 DNA ? 基因組 DNA ? RNA ? 菌落 圖 1 口腔腺中提取的 RNA M: DL2022 marker。 3: 15 μL RNA. M 1 2 3 28S 18S 5S 2022/9/20 4 第七章 PCR技術(shù)及其應(yīng)用 ?一、 PCR技術(shù)原理 ?二、 PCR技術(shù)的主要類(lèi)型 ?三、 PCR技術(shù)應(yīng)用 2022/9/20 5 ㈠ PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? DNA的復(fù)制 ? DNA變性與復(fù)性 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解鏈酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長(zhǎng) 一、 PCR技術(shù)原理 2022/9/20 6 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? DNA的復(fù)制 ? DNA變性與復(fù)性 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長(zhǎng) GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 2022/9/20 7 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? DNA的復(fù)制 ? DNA變性與復(fù)性 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長(zhǎng) GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGACCTACC 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 2022/9/20 8 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 DNA的復(fù)制 DNA變性與復(fù)性 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明 2022/9/20 9 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? DNA的復(fù)制 ? DNA變性與復(fù)性 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ? 1971年 ， Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性 ， 與合適引物雜交 ， 用DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆 tRNA基因 。 ? 耐熱 DNA聚合酶 的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進(jìn)行 2022/9/20 11 DNA polermases for PCR: Thermus aquaticus 古細(xì)菌 水生棲熱菌 最適生長(zhǎng)溫度 70℃ ，具有5’ 3’聚合酶活性和 5’ 3’外切酶活性 2022/9/20 12 Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) 酶活性(%) 溫度 (℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 2022/9/20 13 引物 引物 Mullis的構(gòu)思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定 DNA片段 2022/9/20 14 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) 2022/9/20 15 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? DNA的復(fù)制 ? DNA變性與復(fù)性 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ? 耐熱 DNA聚合酶 的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進(jìn)行 ， 隨后 PECetus公司推出了第一臺(tái) PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀 ? 1989年美國(guó) 《 Science》 雜志列 PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首 ,比喻1989年為 PCR爆炸年 , Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 。 2022/9/20 16 2022/9/20 17 PCR Cycle Step 1 Denaturation Template DNA by Heat (95℃ ) 2022/9/20 18 Target Sequence Target Sequence PCR原理示意圖 ①模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 9395℃ 左右一定時(shí)間后 ,使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離 ,使之成為單鏈 ,以便它與引物結(jié)合 ,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； PCR Cycle Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences 2022/9/20 19 ②模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后 ,溫度降至 5
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