【正文】 混合在一起，二者即可通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入 DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。 即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的 DNA分子。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。端，如載體上添加一段 polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由 DNA連接酶連接。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。 ? 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。 ? 酶切是否完全，所以要做載體的自連對(duì)照。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 轉(zhuǎn) 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞 重組體的轉(zhuǎn)化 宿主菌或受體細(xì)胞 ? 原核系統(tǒng) 大腸桿菌 枯草桿菌 ? 真核系統(tǒng) 酵母菌酵母 昆蟲細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化） 受體細(xì)胞的選擇： ? 限制缺陷型 : 避免修飾和降解 ? 重組缺陷型： 避免重組整合 ? 轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性 ? 遺傳互補(bǔ)型： 利于篩選 ? 感染缺陷型： 防止感染 感受態(tài)細(xì)胞 （ petent cell） ? 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 ? 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后 ,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源 DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（ Competent cells）。 一、 受體菌的培養(yǎng) ? 從 LB平板上挑取新活化的 E. coli DH5α單菌落 ,接種于 35ml LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 下振蕩培養(yǎng) 12小時(shí)左右 ,直至對(duì)數(shù)生長后期。 二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法 ) ? 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中 ,冰上放置 10分鐘，然后于 4℃ 下3000g離心 10分鐘。 ? 棄去上清 ,加入 4ml預(yù)冷含 15%甘油的 mol/L的 CaCl2 溶液 ,輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置幾分鐘 ,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 感受態(tài)細(xì)胞的制備的操作步驟 為了提高轉(zhuǎn)化效率 , 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： ? 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度 : 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４ ℃ 的培養(yǎng)菌，最好從－ 70℃ 或 20℃ 甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。DH5α菌株的 OD600 為 ,細(xì)胞密度在 5 107 個(gè) /ml左右 (不同的菌株情況有所不同 ),這時(shí)比較合適。 ? 試劑的質(zhì)量 : 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的( AR.),并用超純水配制 ,最好分裝保存于干燥的冷暗處。 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 得到噬菌斑或單菌落 與重組 DNA共同冰浴 而后 42℃ 短暫熱刺激 CaCl2處理 受體細(xì)菌 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細(xì)菌 重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌 轉(zhuǎn) 化 ? 從 70℃ 冰箱中取 200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液 ,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。 ? 42℃ 水浴中熱擊 90秒或 37℃ 水浴 5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻 35分鐘。 ? 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿 ,37℃ 培養(yǎng) 1624小時(shí)。 轉(zhuǎn)化的操作步驟 為了提高轉(zhuǎn)化效率 , 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： ? 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA)。 1 ng的 cccDNA即可使 50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。 ? 一般情況下 ,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。 轉(zhuǎn)化方法 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞系統(tǒng) 永生細(xì)胞系 細(xì)胞特異性的選擇標(biāo)記 對(duì)抗某種藥物 ? 電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。將 DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由 Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。 ? 激光微束穿孔法： 利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進(jìn)入細(xì)胞。 ? 脂質(zhì)體（ liposome）介導(dǎo)法： 將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 重組體克隆的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)化后的克隆群體： 陽性重組子的 篩選與 鑒定 ? 遺傳檢測(cè)法 (根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選 ) 插入失活法 α互補(bǔ)法 ? 限制性酶切法 ? PCR法 ? 雜交篩選法 ? 免疫學(xué)方 法 ? 核苷酸序列測(cè)定法 遺傳檢測(cè)法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。如 pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。 如果外源 DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源 DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活 pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu) pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 α互補(bǔ)法 —— 藍(lán)白篩選 ? 現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個(gè)大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有 β－半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和 N端１４６個(gè)氨基酸偏碼區(qū)（全長 1201氨基酸） 。 ? 受體菌是 Z基因突變型，只含編碼 β－半乳糖苷酶Ｃ端 aa的序列。 ? 具有 α互補(bǔ)的細(xì)菌培養(yǎng)在含 IPTG及 Xgal（ 5溴 4氯 3吲哚 β