基因工程技術(shù)概述-在線瀏覽
2025-02-09 09:23本頁面
【正文】 eing replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA The Nobel Prize in Chemistry 1980 定義： ? 基因工程（ gene engineering） 重組 DNA技術(shù) （ rebinant DNA technique）：是指在各種酶的作用下，將細(xì)胞外的核酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細(xì)菌或其它載體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組 DNA分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無性繁殖（稱之為 “克隆” ）和 表達(dá) ，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù) ,人為的改造基因 ,改變生物的遺傳性狀的系列過程 ,總稱為基因工程 基因克隆 (gene cloning )： 是指目的基因與載體 DNA連接構(gòu)成的 DNA重組體在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù) 。 基因表達(dá) (gene expression)： 是指目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，研究功能。 ? 轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體，進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)合成 ,生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。 ? 加保護(hù)堿基， 13個。 ? 啟始及終止密碼子。 片斷的回收與純化 載體： ? 載體 (Vector)是目的基因的運載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。 ? 表達(dá)載體 (expression vector) 使 目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá) 的載體。 穿梭載體 (shuttIe vector) 能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體 . 其可同時具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點和真核生物可識別的 復(fù)制原點或酵母菌的自主復(fù)制序列（ ARS），它即能在 原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá) 。 質(zhì)粒載體 ? 具有 復(fù)制起始點 ，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。 ? 具有某種 選擇性標(biāo)記 以區(qū)別轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。（ Ampr； Tetr） ? 具有若干限制性內(nèi)切酶 單一 識別位點，便于外源基因插入。 克隆載體 : PBR322 特點： ? 分子量小， ，便于操作。 ? 有幾個常用的限制性內(nèi)切酶的單一位點，分布在抗性基因上， 7種位于四環(huán)素選擇標(biāo)記上， 4種位于 Amp抗性基因上。 ? 松弛性質(zhì)粒，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有較高的拷貝數(shù)，當(dāng)細(xì)菌蛋白質(zhì)合成停止時，它仍能繼續(xù)復(fù)制。 pCDNA3系列 (Invitrogen)， 真核表達(dá)載體： 大多是穿梭載體。 載體 易 自身環(huán)化 。 （ b） 目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶 切割后連接 ， 可控制目的基因的插入方向 (定向克隆 )。如加上一個人工接頭內(nèi)含 GAATTC序列，用 EcoRI酶切，產(chǎn)生 EcoRI 粘性末端。 同尾酶 (xho I 。 （ 2） EcoRISalI定向，一般不會有載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活 （ 3） XbaISalI反向，不能進(jìn)行表達(dá)。四環(huán)素失活 （ 5） Not I修平 SalI 一個粘性末端，一個平端 SmaI修平 SalI 正向連接，四環(huán)素失活 PstI ？ SacI ？ 連接濃度： ? 片段與載體連接機率＞自身環(huán)化 ? 一般計算公式： 粘性末端： 載體片段含量（ ng） /載體長度（ kb） 1 DNA片段含量（ ng） / DNA片段長度（ kb） 35 平末端 1： 5 10
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