基因工程技術概述-閱讀頁
2025-01-18 09:23本頁面
【正文】 ﹦ 連接反應： 10ul 體系 H2O Buffer Vector Insert ligase 4/14℃ 過夜 連接反應條件 連接酶的活性 。 PH值 。需要一條 DNA鏈的 3‘ 末端具有游離的 OH，另一條 DNA鏈 5’ 末端的磷酸基團 P，吸能反應，需 ATP存在。但不能連接兩條單鏈 DNA分子和環(huán)化的單鏈DNA分子。 ? T4DNA連接酶： 是從感染 T4噬菌體的 E． coli中分離得到的一種連接酶。用途比 DNA連接酶廣泛，是分子生物學研究及基因克隆中較常用的連接酶。在合適的反應系統(tǒng)中，這種酶使 DNA片段平末端的 3′ OH加上同聚核苷酸，產生具有 poly（ A）、或 poly（ T）、或 poly（ G）、或 poly（ C）的粘性末端。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來源于大腸桿菌的細菌堿性磷酸酶（ BAP）和來源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（ CIP）。 重組子導入受體細胞： ? 把重組 DNA導入受體細胞進行擴增 .根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細胞（原核，真核）及選擇適宜的轉化或轉染的方法。 重組子導入受體細胞：途徑 ? 轉化： 質粒 DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌（感受態(tài)菌）的過程 ? 轉染：噬菌體、病毒、或以它作為載體構建的重組子主動或被動被導入細胞的過程。 轉化 ? 受體細胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細胞 ? 轉化機理：細菌細胞的生物學特性由于吸收外源 DNA發(fā)生可遺傳的改變。一般每微克完整的 pBR322DNA產生 105107 轉化細胞 感受態(tài)菌制備 ? 感受態(tài)： 細菌細胞處于一個容易吸收外源 DNA狀態(tài)，這種狀態(tài)的細菌稱為感受態(tài)菌。 非選擇性培養(yǎng)基上生長數(shù)小時，球狀細胞復原開始增殖 ,抗生素基因表達。變性處理的質粒 DNA和染色體 DNA通過致冷或恢復中性 pH，開始復性。線狀DNA變性時彼此分開，復性慢而不準確，互相之間聚集形成較大的網(wǎng)狀結構，離心后，與變性蛋白質和 RNA一道沉淀下來，上清液中留存下的主要是環(huán)狀 DNA分子和少量的可溶性蛋白質和部分的 RNA，這些可溶性蛋白質和部分的 RNA可 通過苯酚抽提及RNA酶處理去除。低滲，細胞變的脆弱而易于裂解， EDTA螯和金屬離子，防止 DNA降解。 NaOH使細胞裂解，釋放出質粒 DNA和染色體 DNA。降低反應 pH值，起中和作用。 , January 24, 2023 ? 雨中黃葉樹，燈下白頭人。 :51:5601:51Jan2324Jan23 ? 1故人江海別，幾度隔山川。 :51:5601:51:56January 24, 2023 ? 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 。 2023年 1月 24日星期二 1時 51分 56秒 01:51:5624 January 2023 ? 1做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。 , January 24, 2023 ? 很多事情努力了未必有結果，但是不努力卻什么改變也沒有。 :51:5601:51Jan2324Jan23 ? 1世間成事，不求其絕對圓滿，留一份不足，可得無限完美。 :51:5601:51:56January 24, 2023 ? 1意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 。 2023年 1月 24日星期二 1時 51分 56秒 01:51:5624 January 2023 ? 1空山新雨后，天氣晚來秋。 , January 24, 2023 ? 閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 :51:5601:51Jan2324Jan23 ? 1越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯兒。勝人者有力，自勝者強。 2023年 1月 24日星期二 上午 1時 51分 56秒 01:51: ? 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。 2023年 1月 24日星期二 1時 51分 56秒 01:51:5624 January 2023 ? 1一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不
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