基因工程工具酶限制酶(參考版)
2025-05-29 06:03本頁(yè)面
【正文】 Thank you Gene engineering 。 這在切割大量 DNA時(shí)不失為一大節(jié)約方法 。 但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的 1／ 10，否則 ， 限制酶活性將受到甘油的抑制 。 操作要盡可能快 ， 用完后立即將酶放回冰箱 ， 以使酶在冰箱外放置的時(shí)間盡可能縮短 。 進(jìn)行酶切消化時(shí) ， 將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即加以混勻， 再?gòu)谋鋬?nèi)取出貯酶管 ， 立即放置于 冰 上 。 但 切勿用水稀釋以免酶變性 。 這樣 ， 你可以取到少至 0． 1ul的酶 。 8. 使用限制酶的注意點(diǎn) 1） 限制酶十分昂貴 !遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開(kāi)支 。 6) 如果消化后 DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析 ， 可加入 6ul凝膠電泳加樣緩沖液 ， 振蕩混合后 ， 即可加樣進(jìn)行電泳 。 4) 將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育 。 3) 加入 1— 2單位限制酶 ， 輕彈管外壁以混勻之。 2) 加入 2ul適當(dāng)?shù)?10X限制酶消化緩沖液 。 7. 利用限制酶對(duì) DNA進(jìn)行消化的具體步驟 限制酶消化反應(yīng)的進(jìn)行 以下是對(duì) 0． 2— 1． 0 ugDNA進(jìn)行消化的典型反應(yīng)步驟 ， 如要對(duì)更大量的 DNA進(jìn)行消化 ， 則反應(yīng)的各個(gè)成分須相應(yīng)放大 。 此外 ， 還可以用等體積的 酚抽提 酶解產(chǎn)物 ，提取 DNA。 6. 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止 消化 DNA樣品后 ， 在進(jìn)一步處理 DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性 ， 鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是 65℃ 溫浴 5分鐘 。 例如 ， 最常用的EcoRI限制酶 ， 在正常的情況下 ， 是在 G AATTC識(shí)別序列處發(fā)生切割作用的 ， 但如果緩沖液中的甘油濃度超過(guò) 5％ (V／ V)， 那么其識(shí)別序列的特異性就會(huì)發(fā)生松動(dòng) ， 可在 AATT或 PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用 。 在 “ 非最適的 ” 反應(yīng)條件下 (包括高濃度的核酸內(nèi)切限制酶 、 高濃度的甘油 、 低離子強(qiáng)度 、 用Mn2+取代 Mg2+以及高 pH值等等 )， 有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生 “ 松動(dòng) ” ， 從其 “ 正確 ” 識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割 DNA分子 。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對(duì)地需要二價(jià)的陽(yáng)離子，通常是 Mg2+。 (5) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、 TrisHCl,223。 此外 ， 還有一些核酸內(nèi)切限制酶 ， 切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn) ， 其效率亦有明顯的差別 。 (4)DNA的分子結(jié)構(gòu) DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響 。 大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是 37℃ ， 但也有許多例外的情況 ，它們要求 37℃ 以外的其它反應(yīng)溫度 。 (3) 酶切消化反應(yīng)的溫度 DNA消化反應(yīng)的溫度 ， 是影響核酸內(nèi)切限制酶活性的另一個(gè)重要因素 。 (2) DNA的甲基化程度 核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制 —
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