基因工程工具酶限制酶-資料下載頁
2025-05-26 06:03本頁面
【正文】 RI*表示 。 6. 限制性內(nèi)切酶反應的終止 消化 DNA樣品后 ， 在進一步處理 DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性 ， 鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是 65℃ 溫浴 5分鐘 。 但有些酶 ， 如 BamHI和 HaeⅡ 對熱穩(wěn)定 ， 則需加入終止反應液 (如加入 0． 5mol／ L的 EDTA使之在溶液中的終濃度達到 10mmol/L)螯合 Mg2+，以終止反應 。 此外 ， 還可以用等體積的 酚抽提 酶解產(chǎn)物 ，提取 DNA。 如果用限制性內(nèi)切酶消化 DNA分子后 ， 為了進行凝膠電泳分析 ， 則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液 ， 振蕩混合后 ， 直接上樣進行凝膠電泳 。 7. 利用限制酶對 DNA進行消化的具體步驟 限制酶消化反應的進行 以下是對 0． 2— 1． 0 ugDNA進行消化的典型反應步驟 ， 如要對更大量的 DNA進行消化 ， 則反應的各個成分須相應放大 。 1) 將 DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻 ， 使總體積為 18ul。 2) 加入 2ul適當?shù)?10X限制酶消化緩沖液 。 輕敲管外壁以混勻之 。 3) 加入 1— 2單位限制酶 ， 輕彈管外壁以混勻之。 1單位酶 通常定義為 ， 在建議使用的緩沖液及溫度下 ， 在 20u1反應液中反應 1小時 ， 使 l ug DNA完全消化所需的酶量 。 4) 將上述混合的反應物置于適當溫度并按所需的時間進行溫育 。 5) 加入 0． 5mol／ L EDTA(pH8． 0)使終濃度達10mmol／ L， 以終止反應 。 6) 如果消化后 DNA直接進行凝膠電泳分析 ， 可加入 6ul凝膠電泳加樣緩沖液 ， 振蕩混合后 ， 即可加樣進行電泳 。 如欲純化消化后的 DNA， 可用酚：氯仿和氯仿各抽提 1次 ， 再用乙醇沉淀 DNA。 8. 使用限制酶的注意點 1） 限制酶十分昂貴 !遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開支 。 為能從貯存管內(nèi)取出小量的酶 ， 只要用一次性使用的移液器吸頭在酶溶液表面輕沾一下即可 。 這樣 ， 你可以取到少至 0． 1ul的酶 。 濃縮的限制酶也可在使用前用 1X限制酶緩沖液稀釋 。 但 切勿用水稀釋以免酶變性 。 2) 限制酶在 50％ 甘油中保存于 20℃ 時是穩(wěn)定的 。 進行酶切消化時 ， 將除酶以外的所有反應成分加入后即加以混勻， 再從冰箱內(nèi)取出貯酶管 ， 立即放置于 冰 上 。 每次取酶時都應換一個無菌吸頭 ， 一旦限制酶中 污染 了 DNA或其他酶， 將造成財力和時間上的浪費 。 操作要盡可能快 ， 用完后立即將酶放回冰箱 ， 以使酶在冰箱外放置的時間盡可能縮短 。 3) 盡量 減少反應中的加水量 以使反應體積減到最小 。 但要確保酶體積不超過反應總體積的 1／ 10，否則 ， 限制酶活性將受到甘油的抑制 。 4) 通常 延長消化時間 可使所需的酶量減少 。 這在切割大量 DNA時不失為一大節(jié)約方法 。 在消化過程中 ， 可取少量反應液進行微膠電泳以判斷消化進程 。 Thank you Gene engineering
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