基因工程工具酶限制酶-資料下載頁
2025-05-26 06:03本頁面
【正文】 RI*表示 。 6. 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止 消化 DNA樣品后 ， 在進(jìn)一步處理 DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性 ， 鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是 65℃ 溫浴 5分鐘 。 但有些酶 ， 如 BamHI和 HaeⅡ 對熱穩(wěn)定 ， 則需加入終止反應(yīng)液 (如加入 0． 5mol／ L的 EDTA使之在溶液中的終濃度達(dá)到 10mmol/L)螯合 Mg2+，以終止反應(yīng) 。 此外 ， 還可以用等體積的 酚抽提 酶解產(chǎn)物 ，提取 DNA。 如果用限制性內(nèi)切酶消化 DNA分子后 ， 為了進(jìn)行凝膠電泳分析 ， 則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液 ， 振蕩混合后 ， 直接上樣進(jìn)行凝膠電泳 。 7. 利用限制酶對 DNA進(jìn)行消化的具體步驟 限制酶消化反應(yīng)的進(jìn)行 以下是對 0． 2— 1． 0 ugDNA進(jìn)行消化的典型反應(yīng)步驟 ， 如要對更大量的 DNA進(jìn)行消化 ， 則反應(yīng)的各個(gè)成分須相應(yīng)放大 。 1) 將 DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻 ， 使總體積為 18ul。 2) 加入 2ul適當(dāng)?shù)?10X限制酶消化緩沖液 。 輕敲管外壁以混勻之 。 3) 加入 1— 2單位限制酶 ， 輕彈管外壁以混勻之。 1單位酶 通常定義為 ， 在建議使用的緩沖液及溫度下 ， 在 20u1反應(yīng)液中反應(yīng) 1小時(shí) ， 使 l ug DNA完全消化所需的酶量 。 4) 將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育 。 5) 加入 0． 5mol／ L EDTA(pH8． 0)使終濃度達(dá)10mmol／ L， 以終止反應(yīng) 。 6) 如果消化后 DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析 ， 可加入 6ul凝膠電泳加樣緩沖液 ， 振蕩混合后 ， 即可加樣進(jìn)行電泳 。 如欲純化消化后的 DNA， 可用酚：氯仿和氯仿各抽提 1次 ， 再用乙醇沉淀 DNA。 8. 使用限制酶的注意點(diǎn) 1） 限制酶十分昂貴 !遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開支 。 為能從貯存管內(nèi)取出小量的酶 ， 只要用一次性使用的移液器吸頭在酶溶液表面輕沾一下即可 。 這樣 ， 你可以取到少至 0． 1ul的酶 。 濃縮的限制酶也可在使用前用 1X限制酶緩沖液稀釋 。 但 切勿用水稀釋以免酶變性 。 2) 限制酶在 50％ 甘油中保存于 20℃ 時(shí)是穩(wěn)定的 。 進(jìn)行酶切消化時(shí) ， 將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即加以混勻， 再從冰箱內(nèi)取出貯酶管 ， 立即放置于 冰 上 。 每次取酶時(shí)都應(yīng)換一個(gè)無菌吸頭 ， 一旦限制酶中 污染 了 DNA或其他酶， 將造成財(cái)力和時(shí)間上的浪費(fèi) 。 操作要盡可能快 ， 用完后立即將酶放回冰箱 ， 以使酶在冰箱外放置的時(shí)間盡可能縮短 。 3) 盡量 減少反應(yīng)中的加水量 以使反應(yīng)體積減到最小 。 但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的 1／ 10，否則 ， 限制酶活性將受到甘油的抑制 。 4) 通常 延長消化時(shí)間 可使所需的酶量減少 。 這在切割大量 DNA時(shí)不失為一大節(jié)約方法 。 在消化過程中 ， 可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微膠電泳以判斷消化進(jìn)程 。 Thank you Gene engineering
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