dna限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制-資料下載頁(yè)
2025-01-05 02:55本頁(yè)面
【正文】 o r 模板 PC R 等位基因(無(wú) 突變) 模板 等位基因(有 突變) 無(wú)P C R 產(chǎn)物 PCR(Allele specific PCR,ASPCR) 該法可用于檢測(cè)點(diǎn)突變。如用于檢測(cè)鐮刀形貧血癥。 PCR(inverserar inverted PCR) 該法可用于擴(kuò)增已知 序列兩側(cè)的未知序列 R2 X Lig aseY R1 Y39。 X Z R2 R1 P1 Z R2P2 PCR(reverse transcription PCR, RTPCR) 主要用于 mRNA的 PCR擴(kuò)增 mRN A引物1539。RT5 39。 339。AAA ...A339。 TTT ...T5 39。339。AAA ...ARNa seH539。339。TTT ...T5 39。 339。AAA ...A539。339。TTT ...T5 39。 339。AAA ...A539。339。TTT ...T539。339。539。 339。539。339。RT539。339。 TTT ...TTdT + d GT PGG. .GCC. .C 限 制酶識(shí)別序列 限 制酶識(shí)別序列 PCR(Addon PCR) 在合成引物時(shí)加上研究者所需要的核苷酸序列，如某種限制酶的識(shí)別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列 PCR（ mismatched PCR) 利用該法可在一已知 DNA序列中引起點(diǎn)突變，缺失突變和插入突變。 P1 P3 P2 靶順序 P4 分別擴(kuò)增 539。 339。 339。 539。 539。 339。 339。 539。除去引物變性/復(fù)性P1 P4 產(chǎn)生點(diǎn)突變D N APCR延伸339。539。539。339。 PCR(Rebinant PCR) 利用該法可將不同基因的 DNA片段連接在一起。 與基因2啟 動(dòng)子同源基因1編碼區(qū)PCR539。339。變性/復(fù)性啟動(dòng)子與基因1編 碼區(qū)同源PCR539。3’339。5’539。 3’339。 5’539。3’339。539。鏈延伸基因2339。 5’539。 3’14. 基因克隆 PCR 利用該法可獲一完整的 cDNA克隆。 SP6 T7PC R IPC R IIPC R II I四 . 定量 PCR技術(shù) 1. 基本原理 N=N0(1+eff)n N最終拷貝數(shù)； N0起始拷貝數(shù)； eff擴(kuò)增效率； n擴(kuò)增次數(shù) 2. 測(cè)定方法 競(jìng)爭(zhēng) PCR法 (加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)物 )； RTPCR轉(zhuǎn)錄法 五． PCR技術(shù)的應(yīng)用 1. 遺傳疾病的診斷 人類鐮刀型貧血癥是因第六個(gè)密碼子的第二個(gè)字母發(fā)生了A→T 的改變，從而導(dǎo)致該位點(diǎn)的谷氨酸為纈氨酸所取代 。A→T 突變還導(dǎo)致限制酶 OxaNI位點(diǎn)的消失 。 利用 PCR技術(shù)和限制酶譜分析診斷此分子疾病大致過(guò)程如下： DNA擴(kuò)增 PAGE 染色 觀察 比較不同個(gè)體的結(jié)果 限制酶切 PAGE 染色 觀察 此法可在 34 h獲得結(jié)果，比常規(guī)的 Southern雜交法簡(jiǎn)便、快速。 Pr i me rOx a NIOx a NIOx a NIASOx a NI2 9 41 9 11 0 3擴(kuò)增產(chǎn)物 AA AS SS 如果已知某種病原菌 (體 )中的特異性 DNA片段的核苷酸序列，這個(gè)片段就可以用于 DNA擴(kuò)增，并利用 DNA雜交或凝膠電泳的方法診斷病原體的存在與否。 例如 AIDS的診斷，常規(guī)方法是利用血清背景和病毒培養(yǎng)，往往需要 34個(gè)星期，采用 PCR技術(shù)則只需一天左右，且準(zhǔn)確率高 根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì) PCR引物 ,可直接在不同的樣品中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ,而不必分離純化生物樣品 4. 基因突變 1）缺失突變 2）插入突變 3）點(diǎn)突變 單點(diǎn)和多點(diǎn)突變 六 . 等溫 3SR(selfsubstained sequence replication)反應(yīng)系統(tǒng) 七 . 等溫鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng) (SDA, strand displacement amplification) T7 RNA po l引物1 + RT539。339。5 39。 3 39。339。 539。RNa seH引物2539。 339。339。 539。T7 RNA po l引物2 + RT反義RNA3 39。5 39。引物1539。 339。3 39。 5 39。539。 339。3 39。 5 39。RNa seHRT539。 339。5 39。5 39。 3 39。339。 539。339。 539。539。339。RTT7 prom ot erT7 prom ot ermRN A引物1539。RT引物25 39。339。AAA ...A339。 TTT ...T5 39。339。AAA ...ARNa seH539。339。TTT ...T5 39。 339。AAA ...A539。339。TTT ...T5 39。 339。AAA ...A539。339。TTT ...T539。339。539。 339。539。339。RT等溫3SR反應(yīng)系統(tǒng) (selfsubstained sequence replication) GT T GA C539。 339。339。 539。 po l IK + 339。GT T GA C339。539。CA A CT GSSHi n cI I539。 539。 339。GT T G AC339。539。CA A CT GSS鏈取代Hi n cI I539。 G AC 339。339。GT T G ACS339。 539。CA A CT GSS539。 539。 339。339。539。CA A CT GSS鏈取代539。 G AC S339。339。GT T G ACS339。 539。CA A CT GSS539。 GT T G ACS等溫鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng) (SDA, strand displacement amplification) 339。539。339。539。 T2T1P1P2T1T2PO 1 IK + d NT P + d NT TP α SHi n cI I鏈取代T2T1變性/與 引物復(fù)
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