dna限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制-展示頁
2025-01-14 02:55本頁面
【正文】 SV40(5243bp) pBR322(4363bp) 2) 部分酶切 3. 酶切反應(yīng)最適條件 1) DNA分子的組成 i. 堿基組成與排列方式 ii. 識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)的堿基組成與排列方式 ， 同一 DNA分子中不同識(shí)別位點(diǎn)的酶切速度可相差 10倍 （ 如 λ中的 EcoRI位點(diǎn) ） 2) 反應(yīng)條件 i. DNA溶液的純度和濃度 （ 反應(yīng)濃度 ） 依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩? HpaI(C CGG) 1 26 ThaI (CG CG) 0 23 ii. 限制酶的純度和穩(wěn)定性 i) 純度：盡可能保持廠家推薦的反應(yīng)條件 ii) 穩(wěn)定性：保存和反應(yīng) iii. 反應(yīng)緩沖液 ： 常用三種核心緩沖液，即高（ H），中（ M），低（ L）鹽緩沖液，不同溫度下的 pH值 iv. 反應(yīng)溫度 ： 大多數(shù)為 37℃ v. 雙酶切和多酶切反應(yīng) 同時(shí)酶切和分別酶切。 i) 第一種酶切 電泳檢查 酚 /氯仿純化 第二種酶切。 ii) 采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切 電泳檢查 采用高濃度鹽緩沖液的限制酶切。 假如兩酶切位點(diǎn)相距很近（如多克隆位點(diǎn)區(qū)），首先考慮的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時(shí)，其結(jié)果大不相同。要確定其位置，可采用下述輔助方法之一。 ii. 末端標(biāo)記完全酶切 DNA片段 末端標(biāo)記 完全酶切 凝膠電泳 EtBr染 色觀察 放射自顯影 2) 雙酶切作圖法 單酶切結(jié)果只能確定一種酶的位點(diǎn)，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時(shí)則不行 分別作圖時(shí)，同一種酶的兩種作圖法都是對(duì)的，但當(dāng)作在一張圖上時(shí)，上述兩種可能性中只有一種是對(duì)的，因此必須進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，其結(jié)果見圖 根據(jù)上述的原理和步驟，前述的 5 Kb片段酶 I與酶 II的定位結(jié)果可用兩種方法之一： i) 單酶切 分離 DNA片段 第二種酶切 凝膠電泳 ii)單酶切 第二種酶切 凝膠電泳 *如果要同時(shí)將兩種限制酶定位在一條 DNA上時(shí)，單酶完全酶切作圖就沒必要了。 現(xiàn)假設(shè)有一片段長(zhǎng) 10 Kb，其中 RE1有三個(gè)切點(diǎn)， RE2有一個(gè)切點(diǎn)，其圖譜可能是 : 4. Bal31順序酶解作圖法 DNA片段 Bal31處理不同時(shí)間取樣終止反應(yīng) 限制酶切 凝膠電泳 染色觀察結(jié)果 5. 切口移位作圖法 (可檢測(cè)出 100bp片段 ) 雙鏈 DNA 切口移位 限制酶切 電泳 放射自顯影 6. 大尺度限制酶作圖 1) 條件 i. 電泳方法 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 ii. 樣品制備 原位 DNA制備和酶解 iii. 人工染色體構(gòu)建 pYAC載體構(gòu)建 iv. 脊椎動(dòng)物基因組中的 CpG和植物基因組中的 CpXpG序列存在 2) 一般作圖程序 原位 DNA樣品制備 原位 DNA限制酶切 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 染色 觀察 3) 大尺度作圖用酶 i. 稀有識(shí)別序列內(nèi)切酶 I型內(nèi)含子內(nèi)切酶 (真菌細(xì)胞核和線粒體基因組 ,T4噬菌體 ,衣藻葉綠體和線粒體 )；酵母HO內(nèi)切酶；大腸桿菌 recA 雖然這些內(nèi)切酶識(shí)別的序列都很長(zhǎng)： 1019 bp，但高等動(dòng)植物基因組中含有這類位點(diǎn)卻極少，因而很少使用 ii. II型限制酶 人基因組有 45,000個(gè) CpG島 ,一個(gè)長(zhǎng)度約為 kb富含 GC的DNA片段 ,其中只有 25%的 CpG島未被甲基化 ,這些 CpG島常位于基因的 5’端 ,未被甲基化的 CpG島平均長(zhǎng)約 270 kb 可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識(shí)別 8或 6 bp序列；富含或只含 GC序列；含有 CpG序列 i) AscIGGCGCGCC和 NotIGCGGCCGC ii) FseIGGCCGGCC和 SrFIGCCCGGGC iii) SfiIGGCCNNNNNGGCC iv) CpoI/CspI/RsrIICGGA(T)CCG v) BssHIGCGCGC,EagICGGCCG和 SacIICCGCGG vi) NaeIGCCGGC,NarIGGCGGC,SmaICCCGGG vii) MluIACGCGT, NruITCGCGA, PvuICGATCG, SplICGTACG CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 三 . 限制酶圖譜的用途 1. 基因工程中的應(yīng)用 1) 克隆載體圖譜 ,便于 DNA重組 。臨床診斷時(shí)，將遺傳病可疑患者的限制酶譜與之比較 ,便可判斷其是否患有此病 . 第五節(jié) DNA 的 連 接 一 . DNA的連接方法 兩種不同的 DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進(jìn)行連接 ,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的 DNA結(jié)構(gòu) . 1. 直接連結(jié)法 該法適用于 : 1) 同種限制酶作用不同 DNA片段產(chǎn)生的 相同粘性末端 重組 DNA可用同種酶再切開 ,但識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶除外(如 AraI) 2) 不同種限制酶作用不同 DNA片段產(chǎn)生的 相容性末端 DNA分子不能再為這兩種酶所作用 ,如 :BamHI/BglII DNA分子可為其中一種酶所作用 ,但為另一種酶作用的可能性較小 ,如 MboI/BamHI 3) PCR產(chǎn)物與特定載體的連接 4) 限制酶和其他方式產(chǎn)生的 平整末端 . 1) 人工接頭（ linker）的結(jié)構(gòu) i. 中軸對(duì)稱互補(bǔ) ,可自行退火形成雙鏈 .如 :
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