【正文】 ++++摻入的HdNTTP微克分子數(shù)3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1. 25 m M磷 酸緩沖液2. 25 m MT ri s H Cl 緩沖液3. 25 m M甘 氨酸緩沖液Taq DNA聚合酶的特性 當采用 Taq DNA聚合酶進行 DNA體外擴增時，必須考慮到以下五個參數(shù)： 1） 熱穩(wěn)定性 ：在 PCR循環(huán)中 DNA的變性時間常為 3060″，若循環(huán) 30次，其累計加熱變性時間為 1530′。變性與引物退火dN T P, dd NT P,Kl e no w fr ag .A C G TP C R 擴增產(chǎn)物二． Taq DNA聚合酶的特點 Taq DNA聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌 YT1中分離純化而得。339。339。339。339。539。如果利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針（ allelespecific Oligonucleotide, ASO）與 PCR產(chǎn)物進行雜交，可檢測出 PCR產(chǎn)物的堿基突變。* GAC TCCTG GAHin fIDde I變性/與標 記寡核苷酸探針復性8 3 PCR產(chǎn)物的 OR鑒定 3) 分子雜交 適合于檢測 PCR產(chǎn)物的非限制酶位點上堿基突變。539。* GCTG AGGA C CT339。539。* GGA C CACT CCTG GAA339。539。* GAC TCCTG GA GAC TCCT G GAACTG AGGA C C339。539。*CTG AGGA C CT339。539。*GAC TCCT G GAACTG AGGA C C339。539。b e t a A b e t a S GAC TCCT G GATCTG AGGA C C339。539。339。 GAC TCCT G GCTG AGGA C CTA 539。PCR原理示意圖 2. PCR產(chǎn)物的鑒定 1) PCR產(chǎn)物的大小和限制酶譜分析 b p bp50 0 10 0 600500100RE2) 寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（ OR分析 ，Oligomer Restriction analysis） OR分析對于 PCR產(chǎn)物的限制酶位點上發(fā)生了點突變的檢測極其有用 GAC TCCT G GCTG AGGA C CAT339。5 39。339。539。339。5 39。339。539。引物及延伸，75 ℃339。339。5 39。339。539。339。5 39。339。90 ℃變性解鏈與引物退火，50 ℃539。539。339。5 39。339。539。339。339。5 39。339。539。539。339。339。HCl緩沖液 +兩引物 90℃ 變性 30″ 50℃ 退火 30″ 加入 Taq DNA聚合酶 75℃ 1′ 進入第二次循環(huán) 2530次循環(huán) 90 ℃變性解鏈與引物退火，50 ℃引物及延伸，75 ℃n 次擴增第一次循環(huán)第二次循環(huán)339。CCGGAATTCCGG339。GGCCTTAAGGCC539。CCGGAATTCCGG 339。 2) 克隆片段圖譜可用于次克隆 ,體外突變 ,基因定位 ,核酸定序 . 2. 突變體檢測 遺傳學圖譜必須依賴各種突變體存在 ,因此必然發(fā)生了 基因型和表型的變化 . 限制酶圖譜 不必依賴表型變化 ,酶譜的變化一定是基因型發(fā)生了變化 ,但不一定發(fā)生了表型變化 ,即 表型的變化不一定會導致酶譜變化 . 1) 缺失突變體的檢測 :某 DNA片段消失 ,代之以一較小 DNA片段 . 2) 插入突變體的檢測 :某 DNA片段消失 ,代之以一較大 DNA片段 . 缺失和插入突變體的檢測（ I） I II 點突變的檢測（ II） 3）點突變的檢測 : 某 DNA片段消失 ,代之以兩較小的 DNA片段 .前者的長度等于后兩者長度之和 (位點增加 )；某兩 DNA片段消失 ,代之以一較大 DNA片段，前者的長度之和等于后者長度 (位點消失 ). 3. 重組頻率的測定 同一染色體座位上的等位基因可能具有不同的表型 ,從而構(gòu)成遺傳多型性 .等位基因的限制酶譜也可能具有多型性 ,這就是限制酶片段長度多型性 (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 不同個體 總 DNA 限制酶完全酶切 Southern印跡 雜交 結(jié)果分析 當不同個體交配時 ,除自由組合外 ,也可發(fā)生重組 ,如不同果蠅交配時 ,其后代的表型和限制酶譜可為 : 表型 紅 :白 =1:1, 限制酶譜 30%個體已發(fā)生了重組 . 4. 遺傳疾病的診斷 分析正常人與遺傳病患者的某些 DNA片段的限制酶譜 ,便可發(fā)現(xiàn)其差異 ,并總結(jié)出各種遺傳疾病的限制酶長度多態(tài)性圖。 2. 末端標記 部分酶切作圖法 （ SmithBrinstiel法） DNA片段 末端標記 酶 1切 分離帶標記 DNA片段 酶 2部分酶切 電泳 EtBr染色照相 放射自顯影 結(jié)果 單端標記方法 : 人工合成單端標記法 限制酶切單端標記法 單端標記方法 1 人工合成單端標記法 單端標記方法 2 限制酶切單端標記法 3. 末端標記雙相作圖法 方法 2仍存在兩個不足之處：①酶 1的選擇不能靠近 DNA中央；②需先分離 DNA片段，該法可克服上述缺點。 i. 單酶部分酶切 ：部分酶切時，各種可能性均存在，但只有相鄰的兩個 DNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。 如 SmaIBamH(c), BamHISmaI(p) 二、限制酶圖譜的繪制 1. 完全酶切作圖法 1） 單酶切作圖法 一長度為 5Kb的線狀 DNA分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電泳結(jié)果和各位點的可能性排列。操作簡單，但要分先后。 可不考慮酶切先后順序，但操作步驟多。前者要求兩種酶使用的緩沖液和反應溫度必須相同，即使相同時，一旦發(fā)生部分酶切反應，便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者 分別酶切。第 四 節(jié) DNA限制酶切反應和 限制酶譜繪制 一． DNA的限制酶反應 1. 酶單位定義 : 使 1μg某種 DNA在最適反應條件下和 1小時內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。 2. 酶切反應類型 1) 完全酶切