限制性內切酶酶切的常見問題及解決方法-文庫吧資料
2025-01-14 11:37本頁面
【正文】 良好，則兩種酶可同時切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法： ① 先用在低離子強度的緩沖液中活性高的酶切割 DNA，然后加入適量 NaCl及第二種酶，繼續(xù)反應； ② 使用能夠 使多數(shù)內切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。建議酶切反應的 DNA濃度為 。 4. 多種因素可引發(fā)星型反應： ① 非最適的 pH； ②Co2+ 、 Mn2+、 2n2+取代 Mg2+； ③ 酶濃度大于 25u/ug；④ 鹽濃度降低； ⑤ 高濃度甘油的存在 (12%)； ⑥ 有機溶劑的存在。 2. 濃縮的限制酶可在使用前用 1 限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶失活，用水稀釋的酶不能長期保存。當最終反應液中甘油濃度大于 12％時，某些限制酶的識別特異性降低，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會抑制酶活 性。 需要去掉質粒上 eGFP后的中止子 ,用于融合表達 ,方法是 :在 eGFP片斷的上下游分別設計引物做 pcr后連接 ,上游加 BamH1的酶切位點 ,下游加 Bgl2的酶切位點 (同質粒上的酶切位點 ,不能改 ). pcr 沒有問題 ,連接也有菌落長的很好 ,但是挑了 40 多個克隆 ,都是自連的 ,(我沒有用堿性磷酸酶磷酸化質粒 ).BamH1和 Bgl2的粘性末端是一樣的 ,但是 pcr都沒有 ,所以考慮是自連 . 其他因素排除后 ,我覺得可能是引物合成出錯導致 pcr 產(chǎn)物不能酶切 ,就又在另一個公司合成了引物 ,但是重新做的連接 ,挑了 10個菌做 pcr還是陰性 . 我現(xiàn)在懷疑是不是引物設計的問題了 ,我在酶切位點前面加的保護性堿基會不會影響酶切的效率 .請高手幫忙看一下我的引物 ,謝謝 上游 : ATT GGATCC GGA TCT GCG ATC GCT CC 下游 : ATA AGATCT ACT ACT GCT TCC GTA CAG CTC GTC CAT GC(由于融合表達 ,加了幾個弱性 aa) 限制性內切酶酶切注意事項 在進行限制性酶切反應過程中，影響限制性酶切反應效果的因素較多，要設計酶切反應，一般均應考慮諸如酶切系統(tǒng)、溫度條件、反應體積、底物性質及星型反應等因素。 2. “ 目的基因 1400 位置比較模糊 (還是有 ),900 左右位置 卻更明顯 ,而且下方還有雜帶 . 按道理不應該酶把目的基因切斷 .” —— 仔細分析一下酶切位點，確認除了外源片斷兩端外沒有其它的內部切點。 下表是引自 TAKARA的，我個人覺得應該適合 NEB、 MBI、 PROMEGA等其它的酶，它給出的結果僅考慮了 “ 堿基個數(shù) ” ，對我們可能有幫助。當然，我們大多數(shù)戰(zhàn)友，包括我 自己，考慮最多的是 “ 堿基個數(shù) ” ，對 “ 堿基組成 ” 的考慮通常是采用隨機，或兼顧引物 Tm及 GC％上。 保護堿基的具體設計可以可以看圖 : 我有點不明白，上圖是檢測內切酶在切割不同寡核苷酸時的效率數(shù)據(jù)，怎么能作為保護堿基的設計用呢？我設計引物是隨機設計保護堿基也切得很好呀？望樓主及戰(zhàn)友們賜教 的確，上圖是檢測內切酶在切割不同寡核苷酸時的效率數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)不僅考慮到末端堿基數(shù)量的影響，同時還考慮到了末端堿基組成對酶切效率的影響，唯一存在推敲的是，這些數(shù)據(jù)是使用 “ 寡核苷酸 ”進行實驗的數(shù)據(jù)。保護堿基常見于 PCR 引物設計時，為保護 5` 端外加的內切酶識別位點，使酶切完全而添加。 3. 將離子濃度提高到 100150 mM（若酶活性不受離子強度影響）。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。例如 EcoR I 比 Pst I 對甘油濃度更敏感，而后者則對高 pH 值更敏感一些 (2)。micro。下面列出了導致或抑制星號活性的因素。 大多數(shù)星號活性是可以控制的，做酶切反應時一般不考慮這方面的因素。常見的引起酶識別改變的條件有：單堿基替換、識別序列外側堿基縮短以及單鏈切刻（ 10）。 NEB 已證實下列酶存在星號活性： Apo I（ 2）、 Ase I（ 2）、 BamH I（ 3）、BssH II（ 2）、 EcoR I（ 4）、 EcoR V（ 5）、 Hind III（ 1）、 Hinf I（ 7）、 Pst I（ 8）、 Pvu II（ 9）、 Sal I（ 8）、 Sca I（ 2）、 Taq I（ 10）、 Xmn I（ 2）。 下面附上一些酶熱失活的溫度表 內切酶星號活性 在非理想的條件下，內切酶切割與識別位點相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號活性。在上述混合液中加入 底物 DNA（通常為 λDNA ），調節(jié)溫度至最適反應溫度，溫育 60分鐘。下表注明了每種酶的失活條件。大多數(shù)最適反應溫度是 37℃ 的酶在 65℃ 下溫育 20分鐘即可失活。ppg=18893487 限制性內切酶保護堿基： ... 1amp。 他的寶帖
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