質(zhì)粒的提取和鑒定,dna酶切-資料下載頁
2025-05-26 18:28本頁面
【正文】 NA的酶量為 1單位 (1U)。 雙酶切實(shí)驗(yàn)材料 ? 限制性內(nèi)切酶： EcoRⅠ 、 XbaⅠ 和 HindⅢ ? DNA： λDNA和質(zhì)粒 pCDNAp38 ? 10 buffer H （ 37℃ , ） 90mM Tris?Cl 50mM NaCl 10M MgCl2 ? 10 buffer M（ 37℃ , ） 6mM Tris?Cl 100mM NaCl 6M MgCl2 ? 1mM DTT ? 10 BSA： 1mg/ml ? 無菌水 方法和步驟 1. 反應(yīng)體系配制： 質(zhì)粒 pCDNA3－ p38 10 181。l（ 1181。g） 10 buffer M 2 181。l 10 BSA 2 181。l EcoRⅠ 1 181。l XbaⅠ 1 181。l H2O 4 181。l ————————————————— 總體積 20 181。l 2. 將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺(tái)式離心機(jī)上短暫離心收集液體。 3. Eppendorf管于 37℃ 水浴中反應(yīng) 。 4. 反應(yīng)結(jié)束后 70℃ 滅活 15min或者加入 EDTA至終濃度 10mM終止反應(yīng)。 5. 取 20181。l反應(yīng)液加入 6 loading buffer混勻于 ％瓊脂糖凝膠膠上 150伏電泳，約 30min。 加入 5181。l未酶切對照。 6. 凝膠成像體系觀察記錄結(jié)果。 DNA條帶充分分開后，在紫外燈下細(xì)心切取所要的 DNA條帶。盡量去除多余的凝膠。紫外燈照射DNA片段不要超過 30秒。注意保護(hù)眼睛免受紫外線傷害 。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ? 雙鏈 DNA樣品濃度 (μg/μl) = OD260 核酸稀釋倍數(shù) 50/1000。 ? RNA樣品濃度 (μg/μl) = OD260 核酸稀釋倍數(shù) 40/1000。 （在波長 260nm紫外光下， 1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈 DNA濃度為 50μg/ml；單鏈 DNA為 37 μg/ml；RNA為 40 μg /ml。） 凝膠成像結(jié)果 % Agarose Gel 1 2 3 4 DNA ladder 2. CDNA3p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3p38 DNA ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel IV 思考題 ，用堿變性法小量提取質(zhì)粒時(shí)要注意什么事項(xiàng)？ I、溶液 II和溶液 III的作用是什么？在實(shí)驗(yàn)中分別加入上述溶液后反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因是什么？ DNA溶液體系出現(xiàn)什么現(xiàn)象？為什么？ DNA時(shí)為什么要用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進(jìn)行？ 5. 在整個(gè)酶切反應(yīng)過程中應(yīng)注意哪些問題？ 6. 如何選擇 DNA和限制性內(nèi)切酶的用量？ 7. 反應(yīng)體系中為何內(nèi)切酶用量不能超過整個(gè)反應(yīng)體系的 10%？
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